3 месяца назад
Нету коментариев

Как вы уже поняли из предшествующего изложения, к регенерации способны многие представители жи­вотного царства. Но форма и масштаб восстанови­тельного роста у разных животных могут серьезно различаться. В этой главе нам предстоит познако­миться с четырьмя известными биологами, которым мы в значительной мере обязаны нашими знаниями о восстановлении утраченных органов. Каждый из этих ученых выбрал свой особый путь изучения проб­лемы регенерации, и вам станет понятно, что како­го-то одного пути решения проблемы не существует. Понимание механизма регенерации может склады­ваться лишь из тщательного сопоставления информа­ции, получаемой с применением самых разных экспе­риментальных подходов.

ЭЛЛИСОН БЕРНЕТТ. РЕГЕНЕРАЦИЯ У ГИДР

Эллисон Бернетт преподает в Северо-западном уни­верситете в Эванстоне, штат Иллинойс. Большую часть своей научной деятельности он посвятил иссле­дованию клеточной организации и процессов роста v гидр (Hydra), относящихся к той же группе беспоз­воночных животных, что и медузы, актинии и корал­лы. Как еще в 1740 году впервые отметил Трамбле, регенерационная способность гидр не уступает по интенсивности регенерационной способности плана­рий. Поэтому не удивительно, что именно исследо­вания регенерации у гидр и планарий явились пред­метом сотен научных сообщений на многих языках мира. Гидры — самый распространенный объект для постановки опытов как с учебной, так и с исследова­тельской целями.

Эти внешне напоминающие растения животные обычно обитают в прудах, прикрепившись к какому-нибудь водному растению или камню при помощи клеточного диска (подошвы), находящегося у основа­ния тела. На противоположном («головном») конце трубкообразного тела гидры расположен рот, откры­вающийся в мешковидную пищеварительную по­лость. Он окружен венчиком щупалец (от шести до десяти), непрерывно двигающихся в поисках пищи. Одним из способов размножения гидр является поч­кование — образование небольших выпячиваний, или почек, в нижней части тела беспозвоночного. Посте­пенно на растущих почках формируются щупальца и другие типичные для гидр органы. Затем дочерняя особь отделяется от родительской и начинает само­стоятельную жизнь. Образующиеся почки придают гидре обличье многоголового существа. Высокая регенерационная способность животного послужила основанием для того, чтобы назвать его по име­ни древнегреческого мифологического чудовища девятиголовой Гидры, способной легко восстанавливать головы, отсеченные в схватке (рис. 33). У гидры и родственных ей животных стенка тела состоит из клеток, покрывающих тело снаружи (эктодермы) и обладающих способностью к сокращению, и клеток, выстилающих пищеварительную полость (энтодер­мы); пространство между этими двумя слоями запол­няет тонкий слой студенистого вещества, называемого мезоглеей. Наиболее часто встречающиеся гидры в длину не превышают 30 миллиметров.

Почкующаяся гидра

Почкующаяся гидра

Э. Бернетт изучал различные свойства гидр. Первые свои работы он посвятил исследованию структуры и функции специализированных клеток этих необычных животных: нервных клеток, которые создают сеть нервных образований в стенке тела, характерную для всех кишечнополостных; желези­стых клеток, входящих в состав энтодермы и секре­тирующих пищеварительные ферменты; а также рас­положенных на щупальцах стрекательных клеток, способных выбрасывать скрученную нить с ядом, парализующим мелких животных, добычу гидры, и в целях защиты. Кроме перечисленных во многих ме­стах тела гидры можно обнаружить небольшие клет­ки, лишенные каких-либо специальных функций; их обозначают как промежуточные, или «интерстициаль­ные», клетки («И-клетки»),

Регенерация у гидры

Следующие свои эксперименты Бернетт посвятил изу­чению особых ростовых факторов, которые, как он счи­тает, выделяются гидрой. В пользу существования та­ких веществ говорили наблюдения над характером ре­генерации у гидры, Бернетту и другим исследователям удалось обнаружить, что зона роста животного находится в стенке тела непосредственно под щу­пальцами. Постоянное образование новых клеток в этой зоне приводит к тому, что лежащие рядом зре­лые клетки постепенно оттесняются в двух противо­положных направлениях — в сторону щупалец и в сторону основания тела,— а новые клетки, дифферен­цируясь, замещают их. Когда «старые» клетки дости­гают концов тела гидры, они слущиваются в окру­жающую водную среду. Согласно изложенной гипоте­зе, в случае, если какие-либо из специализированных клеток погибают до окончания процесса миграции, их место занимают близлежащие И-клетки, которые подвергаются соответствующим изменениям и берут на себя функции замещаемых клеток. Последний способ клеточного замещения наблюдается весьма часто: стрекательные клетки постоянно расходуются в процессе захвата добычи, а железистые — в процес­се пищеварения. В результате организм гидры под­вергается практически непрерывному обновлению (и тем и другим путем), за что это животное не без оснований получило название «бессмертного».

В дополнение к регенерационным механизмам, действующим непрерывно, гидры восстанавливаются и будучи повреждены в результате эксперименталь­ных воздействий. Эти животные способны не только регенерировать любую из утраченных частей, но и полностью восстанавливать тело из любого мельчай­шего фрагмента, за исключением щупалец и подош­вы. В процессе регенерационного роста отмечается явная полярность: при горизонтальном рассечении гидры пополам «головная» часть, имеющая щупаль­ца, восстанавливает от раневой поверхности стебелек с подошвой, и наоборот. На первый взгляд, у гидры отмечается градиент свойств по линии щупальца — подошва, подобный тому, который был описан на примере планарий. Бернетт, однако, высказал иное предположение. Несколько ранее он вместе с други­ми исследователями пришел к заключению, что зона роста под щупальцами выделяет особое ростовое ве­щество, стимулирующее процесс клеточного деления. Теперь же Бернетт предположил, что в той же самой зоне вырабатывается и подавляющее рост вещество и что именно от сочетания этих двух факторов зави­сит процесс как нормального, так и регенерационного роста гидры.

Модель роста гидры

Для иллюстрации справедливости своих гипотез ис­следователи нередко прибегают к созданию моделей тех или иных процессов. Предложенная Бернеттом модель регуляции роста гидры (рис. 34) предпола­гает, что и стимулирующее, и подавляющее рост ве­щества медленно перемещаются от места своей выра­ботки в сторону основания тела животного, причем подавляющее рост вещество состоит из «текучих» молекул, которые постепенно выходят из тела в окру­жающую среду.

Полярность в строении гидры

Полярность в строении гидры

Какие же особенности регенерации гидры дали Бернетту основание для формулировки принципов работы его модели? Прежде всего, характер регене­рации после рассечения. В верхней части, несущей щупальца, продуцируется как подавляющее, так и стимулирующее рост вещества. Логично предполо­жить, что тут будет происходить нейтрализация од­ного фактора другим. И действительно, мы не наблю­даем роста щупалец на рассеченном конце, наоборот, здесь начинает формироваться стебелек с подошвой и восстанавливается характерная для тела животно­го полярность. Рост «головы» на раневой поверхности нижней половины гидры подтверждает два других по­стулата гипотезы: во-первых, в этой половине гидры нет клеток, способных вырабатывать подавляющее рост вещество, и, во-вторых, большая его часть, которая должна была достигнуть этого отдела тела, уже вышла в окружающую среду.

Помимо полярности регенерационного роста гид­ры модель Бернетта объясняет и некоторые аспекты нормальной формы ее роста, в частности размножение путем почкования. С точки зрения гипотезы о нали­чии в теле гидры градиента жизненных процессов по линии «щупальца — подошва» трудно понять механизм почкования. Согласно градиентной модели регенера­ции у планарий, темп любых биологических процес­сов значительно выше в головном конце животного, а у гидры быстрый рост, необходимый для почкования, происходит на участке тела, весьма отдаленном от «головы». Но с другой стороны, именно теория Бернетта легко объясняет наблюдаемое в приро­де явление. Важно только помнить, что предполагае­мый фактор подавления роста наделен повышенной «текучестью». Это создает в нижних отделах тела гидры избыток стимулирующего рост вещества, кото­рый и обеспечивает активное отрастание дочерних особей Б районе стебелька. В «почках» вскоре начи­нается самостоятельная выработка подавляющего рост вещества, чем и объясняется полярность тела вновь образующихся гидр.

Каковы наиболее важные особенности модели регуляции роста гидры, предложенной Бернеттом? Она объясняет, во-первых, как нормальную, так и восстановительную формы роста этих беспозвоноч­ных при помощи одной универсальной теории, и, во-вторых, наблюдаемую полярность роста взаимо­действием двух специфических химических факторов. Это чрезвычайно ценные идеи, но тем не менее модель Бернетта не дает окончательного ответа на все вопросы, связанные с регенерацией у гидры. Ее значение состоит прежде всего в том, что она может послужить основанием для проведения дальнейших экспериментальных исследований, которые в настоя­щее время проводятся как самим Бернеттом, так и другими учеными, интересующимися данной проб­лемой.

МАРКУС СИНГЕР. НЕРВЫ И РЕГЕНЕРАЦИЯ

О значении нервов на определенных этапах регенера­ции конечности у амфибий мы уже говорили. Маркус Сингер из Медицинской школы при Кливлендском университете, штат Огайо, был первым, кто заинте­ресовался взаимоотношением нервной ткани и про­цессов регенерации в самых различных аспектах этой проблемы.

В опытах по денервации конечностей тритона Сингер установил, что регенерация зависит от сохранности нерва вплоть до стадии образования хорошо сформированной бластемы культи. Серия дальнейших весьма интересных исследований позво­лила Сингеру вскрыть возможный путь влияния нерв­ной ткани на восстановительный процесс. Он пришел к заключению, что нервная ткань выделяет какое-то активное вещество, необходимое для протекания ре­генерации. Сингер говорит о необходимости исследо­вания этого «нейротропного» агента на молекуляр­ном уровне.

Качество необходимой нервной ткани

Каждый нерв, находящийся в конечностях позвоноч­ных животных, состоит как бы из двух частей. Одна из них — сенсорная (чувствительная) — переносит нерв­ные импульсы от конечности к центральной нервной системе независимо от того, каков характер раздра­жения конечности. Вторая часть — двигательная, она переносит сигналы от центральной нервной системы к мускулатуре конечности, обеспечивая реакцию на различные виды раздражений. На первых порах Сингер пытался установить, участвуют ли обе части нерва в восстановлении конечности тритона. Для это­го непосредственно перед ампутацией передней ко­нечности тритона ученый рассекал либо все чувст­вительные окончания трех основных нервов конечно­сти, либо все двигательные (рис. 35). Оказалось, что регенерация успешно протекает при обоих вариантах постановки опыта, то есть при сохранении либо дви­гательной, либо чувствительной иннервации. Отсюда можно сделать вывод, что влияние нервной ткани на регенерацию не является качественным, поскольку тип нервного волокна, остающегося в рассеченной ко­нечности, никак не сказывается на ее регенерацион­ной способности. Но что можно сказать о количе­ственной стороне дела? Как сказывается на процессе регенерации количество сохраненной нервной ткани?

Три основных нерва, иннервирующих  переднюю конечность саламандры

Три основных нерва, иннервирующих переднюю конечность саламандры

Количество необходимой нервной ткани

Анализ результатов предыдущих опытов показывает что для нормального восстановления конечности нет необходимости сохранять нервную ткань в обычном количестве. Ведь полное восстановление конечности без чувствительных либо двигательных нервных окончаний идет при явной утрате значительной частя нервов. Но, поскольку полностью денервированная конечность не способна к регенерации, существует, по-видимому, некое минимальное количество нервной ткани, необходимое для ее восстановительного роста. Сингер предложил схему экспериментов, с помощью которых можно было установить значение такого минимума.

Как чувствительные, так и двигательные оконча­ния трех основных нервов конечности состоят из пучков с определенным количеством нервных волокон, связанных между собой соединительной тканью. На первом этапе опыта устанавливали количество воло­кон в каждой из частей этих трех нервов. Подготов­ленные для микроскопирования препараты попереч­ных срезов нетронутых нервов окрашивали таким обра­зом, чтобы можно было подсчитать число волокон как в чувствительном, так и в двигательном компонентах. При различных вариантах рассечения нервов у экспе­риментальных животных легко определить число оставшихся нервных элементов — для этого надо только вычесть число рассеченных из уже известного числа волокон данного нерва. Результаты были до­вольно интересные. Если в конечности оставалось бо­лее 1298 нервных волокон, регенерация протекала нормально, если их количество становилось ниже 793, регенерация не происходила. Если же число со­храненных нервных волокон лежало в пределах от 793 до 1298, восстановление конечности иногда про­исходило, а иногда нет. Таким образом, регенерацию обеспечивает некое среднее число нервных воло­кон (793—1298), так называемый пороговый уро­вень.

Логично предположить, что отсутствие способно­сти к регенерации конечностей у того или иного животного может быть связано с недостижением по­рогового числа нервных волокон. Но дальнейшие эксперименты Сингера показали, что способность к регенерации определяется все же не общим числом оставшихся после ампутации нервных волокон. К это­му заключению он пришел, сравнив число нервных во­локон в конечностях животных ряда видов. У неспо­собных к регенерации животных, таких, как мыши или взрослые лягушки, полученные цифры были значи­тельно ниже порогового числа у тритонов. Но подсчет числа нервных волокон у Xenopus, южноафриканской шпорцевой лягушки, неожиданно показал, что столь же низкое число нервных волокон у этих животных сочетается с хорошо выраженной регенерационной способностью, которая проявляется и во взрослом со­стоянии (рис. 36).

Число нервных волокон на единицу ампутационной поверхности верхней конечности у различных позвоночных

Число нервных волокон на единицу ампутационной поверхности верхней конечности у различных позвоночных

Это противоречие было разрешено, когда допол­нительно к подсчету волокон определили размер нер­вов конечностей у представителей различных групп животных. При этом оказалось, что нервные волокна у Xenopus значительно превышают по диаметру та­кие же волокна у мышей и взрослых лягушек других видов. Вследствие этого степень иннервации конеч­ности Xenopus значительно выше, чем у сравнивае­мых видов животных со сниженной регенерационной способностью. Под влиянием полученных данных пришлось несколько изменить концепцию порогового уровня. Теперь она гласит, что способностью к реге­нерации обладают конечности животных, у которых обеспечивается определенный уровень снабжения ампутированной зоны общим количеством нервной ткани, или нейроплазмы.

По мнению Сингера, концепция порогового уров­ня удачно объясняет, почему в процессе эволюции снижается способность к восстановлению конечно­стей, несмотря на явную эволюционную «полезность» регенерации. Он утверждает, что по мере усложнения центральной нервной системы происходило постепен­ное снижение количества нервной ткани в конечно­стях. В связи с этим у высших позвоночных постули­руемый его теорией пороговый уровень иннервации конечностей не достигается. При этом Сингер счита­ет, что природа не зря поступилась способностью к восстановлению конечностей, пойдя по пути все боль­шего усовершенствования центральной нервной си­стемы. Приобретение способности принимать быст­рые решения, позволяющие животному эффективно защищаться от врагов, обладает в эволюционном плане большей ценностью, чем способность к отраста­нию утраченных частей тела.

Каким образом нервы стимулируют рост тканей?

Следующим этапом было изучение механизмов влия­ния нервной ткани на регенерацию. Сингер предпо­ложил, что на ранних стадиях регенерации регули­рующим воздействием обладает определенное хими­ческое вещество, выделяемое нервами. Денервация конечности саламандр передили во время образова­ния бластемы останавливает регенерацию из-за того, что прекращается выработка этого вещества. А что, если после денервации каким-то образом компен­сировать отсутствие предполагаемого химического фактора-регулятора? Самым трудным при проведе­нии этих опытовоказалось найти способ обработки денервированных регенерирующих конечностей сала­мандр различными химическими веществами. Пробо­вали наносить реагенты непосредственно на поверх­ность культи или вводить их в ткань с помощью шприца. Но ни в том, ни в другом случае возобнов­ления регенерации денервированной культи не про­исходило. Нельзя было исключить и той возмож­ности, что содержащийся в используемых пре­паратах химический стимулятор просто не дости­гал бластемы, как это бывает при его выделении нер­вами в естественных условиях. Для решения этой задачи Сингер предложил специальный аппарат, ко­торый должен был самым близким образом дубли­ровать нормальную деятельность нервов, постепенно выделяя испытываемые вещества непосредственно в бластему конечности. Подобный процесс называется инфузией, в связи с чем изобретение было названо микроинфузионным аппаратом Сингера.

Микроинфузия

Предложенный Сингером аппарат предназначен для непрерывного протекания небольших объемов жидко­сти через конечности тритонов, денервированные на ранней стадии регенерации. Действие аппарата осно­вано на вращении часового механизма, которое пре­образуется в поступательное движение винта. Винт, в свою очередь, приводит в движение поршень небольшого подкожного шприца, подающего раствор в тонкую пластиковую трубочку, вставленную на место иглы. Свободный конец трубочки заканчивается стек­лянным капилляром, который вводится в плечевую область тритона после обезболивания животного и затем проникает в ткани культи и бластемы. Винто­вая часть механизма может быть соединена с под­вижной пластинкой, нажимающей из поршни ряда шприцов,— такая модификация дает возможность проводить одновременнуюинфузию нескольким три­тонам (рис. 37).

После денервации и последующей ампутации в конечности тритонов вводят растворы тех или иных веществ с помощью аппарата Сингера

После денервации и последующей ампутации в конечности тритонов вводят растворы тех или иных веществ с помощью аппарата Сингера

Тритонов держат под наркозом до пяти часов и за это время проводят инфузию различных химиче­ских веществ в регенерирующую конечность. Для того чтобы инфузия соответствовала естественному процессу высвобождения химических веществ тканью нерва, в конечность поступают минимальные объемы испытываемых растворов — около 0,001 миллилитра в час.

Сингер предположил, что наиболее вероятным ве­ществом, оказывающим влияние на регенерационную способность, может быть медиатор (передатчик нерв­ного напряжения) ацетилхолин. Для этого пред­положения имелось несколько причин. Во-первых, известно, что ацетилхолин высвобождается нервной тканью при передаче импульсов. Во-вторых, при опре­делении содержания ацетилхолина в конечности на различных этапах регенерации было обнаружено, что на так называемых нервно-зависимых этапах его ко­личество оказалось большим по сравнению с нормаль­ной тканью. После формирования бластемы и во вре­мя фазы респециализации содержание ацетилхолина возвращалось к нормальному уровню (рис. 38).

Изменения в содержании ацетилхолина на различных этапах регенерации передней конечности у тритона

Изменения в содержании ацетилхолина на различных этапах регенерации передней конечности у тритона

В регенерирующие конечности тритонов на протя­жении разных периодов времени вводили различные концентрации ацетилхолина. Казалось весьма веро­ятным, что инфузия ацетилхолина хотя бы в некото­рых случаях обеспечит возможность регенерации де­нервированной конечности. Но ожидания не оправда­лись. Инфузия денервированных конечностей ни разу не привела к завершению процесса регенерации.

Несмотря на некоторое разочарование, вызванное результатом этих опытов, его все же следует считать ценным, поскольку он исключает один из возможных механизмов влияния нервной ткани на регенерацию и позволяет сосредоточить внимание исследователей на поисках альтернатив.

Молекулярная биология и регенерация конечностей

Природа вещества, с помощью которого нервная ткань оказывает влияние на регенерацию конечно­стей, до сих пор остается невыясненной. Исследовате­ли, занимающиеся этим вопросом, недавно попыта­лись расшифровать механизм воздействия нервов на регенерирующие клетки, надеясь таким образом оп­ределить участвующее в данном процессе вещество.

Когда конечность денервируется в стадии образо­вания бластемы, процесс регенерации прерывается, указывая тем самым на остановку жизнедеятельно­сти клеток бластемы. Вполне логично предположить, что денервация воздействует на одну из наиболее важных функций клеток, а именно на процесс синте­за белков.

Детали процесса синтеза белков в клетках описа­ны в любом руководстве по биологии, но вкратце их можно сформулировать следующим образом. Молеку­лы ДНК, располагающиеся в ядре каждой клетки, содержат закодированную информацию для синтеза различных белков. Они служат своего рода матрицей для формирования молекул информационной РНК, которые переносят указанную информацию к распо­ложенным в цитоплазме клеток рибосомам. Именно здесь происходит процесс сборки белков из отдель­ных «строительных блоков», которыми являются ами­нокислоты. В опытах с использованием радиоактив­ных изотопов Сингер и его сотрудники пытались определить, какое влияние оказывает денервация ко­нечности тритона в ранней фазе образования бластемы на синтез белка в клетках конечности. Они исхо­дили из того, что при денервации данный тип клеточ­ной активности должен останавливаться или хотя бы снижаться.

Аминокислоты, подобно многим другим химиче­ским веществам, могут быть «помечены», если неко­торые из элементов заменить на радиоактивные. По интенсивности включения меченых аминокислот в молекулы белка можно определить уровень синтеза белка в клетках бластемы. Соответственно эффект денервации должен проявиться в изменении уровня включения меченых аминокислот в белки, синтези­руемые клетками бластемы.

Итак, в ткань регенерирующих конечностей трито­нов вводили меченые аминокислоты. Для выявления метки в данном случае применяли не авторадиогра­фию, а другой метод. В разные сроки после введения меченых аминокислот получали бластему, растирали ее и выделяли белки. Пробы полученных материалов помещали в сцинтилляционный счетчик — прибор, позволяющий определить уровень радиоактивности, высвобождаемой определенным количеством белка за минуту.

Результаты проведенных опытов подтвердили ис­ходную гипотезу: препарат белков клеток бластемы денервированных конечностей был значительно менее радиоактивным по сравнению с аналогичным препа­ратом из конечностей, где иннервация была сохране­на. Таким образом, синтез белка в клетках бластемы действительно зависит от присутствия вещества, выделяемого нервной тканью. Для подтвержде­ния этого вывода Сингер провел опыты по куль­тивированию нервной ткани и материал из куль­тур инфузировал в бластемы регенерирующих ко­нечностей, которые были перед тем денервированы. Потом он повторил опыт с радиоизотопным исследо­ванием синтеза белка клетками бластемы. После ин­фузии материала из культур нервной ткани клетки бластем денервированных конечностей включали меченые аминокислоты примерно с той же интенсив­ностью, что и клетки бластем с сохраненной иннер­вацией.

Так впервые был выявлен на молекулярном уровне эффект выделяемого нервной тканью вещества, влияющего на процесс регенерации конечности. От­крытие, важное само по себе, но имеющее и более общее значение,— оно стимулировало интерес ученых к этому аспекту проблемы регенерации и заложило основу изучения специфических регуляторных меха­низмов данного биологического явления.

ЭЛИЗАБЕТ ХЕЙ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОГО МИКРОСКОПА

Электронно-микроскопические исследования, прове­денные Элизабет Хей в Гарвардской медицинской школе, внесли много нового в наше понимание судь­бы отдельных клеток при регенерации. С помощью оптического микроскопа, как мы уже знаем, была определена общая последовательность изменений на уровне клеток, которые происходят в регенерирую­щих конечностях саламандр на стадиях дедифферен­цировки, образования бластемы и редифференциров­ки. Однако ограничение увеличений, достигаемых в оптическом микроскопе, оставляло многие вопросы без ответа. Так, например, при изучении регенерации у планарий микроскопия оказалась неспособной дать ответ, происходит ли формирование бластемы за счет миграции резервных клеток-необластов или за счет дедифференцировки зрелых клеток плоского червя. Тщательные электронно-микроскопические исследо­вания, проведенные Э. Хей, позволили разрешить ряд важных проблем регенерации у беспозвоночных и позвоночных животных и получить много дополни­тельной информации.

Клетки регенерирующей конечности

При использовании обычного оптического микроско­па оставались неразрешенными три основных вопро­са в изучении клеток регенерирующих конечностей саламандр. Первый из них относился к отдельным компонентам клетки, органоидам. Предполагалось, что органоиды клеток культи принимают активное участие в формировании бластемы. Но какие измене­ния претерпевают органоиды при дедифференцировке зрелых клеток? Детали этого процесса не поддаются изучению в оптическом микроскопе.

Второй вопрос вытекал из данных оптической микроскопии, показавшей, что клетки, составляющие бластему конечности, не несут никаких следов про­исхождения от тех или иных «родительских» клеток и по строению неотличимы друг от друга. Действи­тельно ли клетки бластемы идентичны? На это ука­зывали многие данные, но все же нельзя было исклю­чить каких-то различий, невидимых в оптическом микроскопе. Требовались дополнительные исследова­ния для того, чтобы доказать, что клетки бластемы действительно утратили все структурные признаки дифференцированных клеток.

Третья проблема касалась неясности в вопросе о том, какие именно ткани конечности подвергаются дедифференцировке и входят в состав бластемы. В особенности это относилось к утере специализации мышечной тканью культи. Микрофотографии, полу­ченные в оптическом микроскопе, показывали, что рассеченные концы мускулатуры конечности стано­вятся «растрепанными» в следующей за ампутацией стадии «демонтирования» и некоторые мышечные клетки в этом участке отделяются от основной мы­шечной массы, дедифференцируются и мигрируют к раневой поверхности.Тем не менее ряд исследова­телей придерживались точки зрения, что мышечная ткань не подвергается процессу дедифференцировки. Они считали, что после освобождения поврежденных концов нетронутой мускулатуры от клеточного детри­та идет прямое отрастание новой мышечной ткани и проникновение мышц во вновь формируемую часть конечности. Проведенные Хей электронно-микроско­пические наблюдения позволили более детально изу­чить строение цитоплазмы регенерирующих клеток и дали ответ на эти вопросы. Как вы уже, наверное, поняли, для этой цели использовался просвечиваю­щий электронный микроскоп. Исследовали ультра­тонкие срезы нормальных и регенерирующих конеч­ностей аксолотлей со специальным вниманием к структуре клеток мышц и хряща, поскольку эти клетки легко выявляются в зрелом состоянии по вы­деляемым ими специфическим веществам.

Прежде всего был установлен характер клеток двух упомянутых типов в неампутированной конеч­ности. В цитоплазме зрелых хрящевых клеток при больших увеличениях хорошо просматривались мно­гочисленные мембраны и рибосомы — мелкие внут­риклеточные частицы, служащие для сборки белков из аминокислот. Рибосомы находились в тесной свя­зи с мембранными структурами. Можете ли вы вспомнить другой случай выявления подобной карти­ны? Да, нечто подобное мы уже видели на электрон­ных микрофотографиях фибробластов, участвующих в процессе заживления ран. Матрикс, окружающий хрящевые клетки, содержит коллаген, как и ткани рубца, образуемые фибробластами, поэтому оба типа клеток синтезируют молекулы этого белка на ри­босомах, связанных с мембранами. В хрящевых клет­ках нормальной конечности обнаруживается и комп­лекс Гольджи, который является типичным для же­лезистых клеток. В зрелых мышечных клетках прак­тически все пространство цитоплазмы занято пучка­ми сократительного материала, поперечная исчерчен­ность которого четко выявляется при увеличениях электронного микроскопа.

Электронные микрофотографии показали, что мышечные клетки подвергаются трансформации в тканях бластемы. На препаратах, полученных Хей в ранние стадии регенерации, в местах рассечения мы­шечной ткани среди множества ядер оставшейся не­поврежденной мускулатуры были видны границы вновь образующихся клеток. Здесь же обнаружива­лись небольшие клетки, в каждой из них было по одному ядру. Позднее эти клетки, по-видимому, миг­рировали к раневой поверхности конечности и ста­новились клетками бластемы.

При исследовании в электронном микроскопе клетки ранней бластемы конечности аксолотля четко отличались от зрелых мышечных или хрящевых клеток (рис. 39). Например, цитоплазматические мембраны клеток бластемы были фрагментированны­ми, а рибосомы свободно разбросаны по всей цитоп­лазме и не прикреплены к мембранам. Хотя комплекс Гольджи в клетках бластемы оставался раз­личимым, он был гораздо меньше по сравнению с комплексом Гольджи в зрелых клетках хряща. Цито­плазма клеток бластемы была развита чрезвычайно слабо, зато ядра обладали гигантскими размерами и содержали четко выраженные ядрышки. Наконец, поскольку изучение ультраструктуры клеток бласте­мы не выявило даже следов хрящевого матрикса или мышечных фибрилл, было полностью подтверждено заключение, полученное при оптической микроскопии, об идентичности бластемных клеток.

Электронная микрофотография клетки бластемы регенерирующей конечности аксолотля

Электронная микрофотография клетки бластемы регенерирующей конечности аксолотля

На электронных микрофотографиях, сделанных в период редифференцировки, было видно, что «упро­стившиеся» органоиды клеток бластемы по мере вос­становления конечности претерпевают постепенные изменения, характер которых определяется тем, какие именно специализированные клетки возникают на ме­сте бластемы. В расположенных центрально клетках-предшественниках хряща постепенно «проявляются» цитоплазматические мембраны с прикрепившимися к ним рибосомами, комплекс Гольджи становится более выраженным, и вскоре вокруг клеток начи­нает обнаруживаться внеклеточный матрикс. В до­вольно поздних стадиях регенерации, когда уже четко видны границы восстанавливающихся костей, будущие мышечные клетки, расположенные в наруж­ных частях бластемы, еще не имеют признаков респециализации. Но затем проступают и эти признаки, клетки удлиняются, а в цитоплазме начинает выяв­ляться сократительный материал. Еще позже клет­ки сливаются и формируют типичную мышечную ткань (рис. 40). Таким образом, цитологическое ис­следование фазы респециализации регенерирующих конечностей аксолотля позволило ответить на все три вопроса, поставленных в начале раздела.

Диаграмма, изображающая процесс дедифференцировки и редифференцировки клеток мышц и хряща при регенерации у амбистомы

Диаграмма, изображающая процесс дедифференцировки и редифференцировки клеток мышц и хряща при регенерации у амбистомы

Электронная микроскопия и регенерация у планарий

Многие исследователи обнаруживали в оптическом микроскопе группы совершенно неспециализирован­ных клеток, расположенные в разных участках тела плоских червей. Эти клетки не имели каких-либо четких отличий и различались только по характеру окраски их цитоплазмы некоторыми красителями. Поскольку они мигрировали в сторону раневых по­верхностей и участвовали в формировании бластемы, их назвали резервными клетками (необластами). Считалось, что необласты распространены у всех видов плоских червей. Недавно Хей провела электрон­но-микроскопическое исследование этих резервных клеток у нормальных и регенерирующих планарий. Первое, что она обнаружила в клетках нормаль­ных плоских червей,— это значительное число струк­турных деталей, указывающих на то, что исследуемые клетки не были в полном смысле слова неспе­циализированными. Большие увеличения электрон­ного микроскопа позволили увидеть в этих клетках секреторные гранулы и структуры комплекса Гольд­жи — четкие «пограничные столбы» железистых кле­ток. Возникло предположение, что резервные клетки предназначены не столько для реакции на какие-то виды повреждений, сколько для определенной постоянной функции — выработки и выделения слизи. Слизь покрывает тело червя и позволяет ему с по­мощью мышечных сокращений перемещаться по са­мым разным поверхностям.

У регенерирующих планарий электронная микро­скопия выявила своеобразные клеточные потоки, направляющиеся в сторону раневой поверхности. Однако в составе этих потоков были обнаружены не только железистые клетки, но и ряд других специа­лизированных клеток. Позднее близ места рассечения червя мигрировавшие клетки постепенно утрачивали черты специализации, то есть дедифференцировались точно таким же образом, как клетки в регенерирую­щих конечностях земноводных. По достижении ране­вой поверхности все мигрирующие клетки оказыва­лись полностью дедифференцированными и были готовы к формированию бластемы. Необласты, таким образом, были совершенно не нужны.

Как видите, электронная микроскопия во мно­гих случаях подтверждает данные, основанные на наблюдениях в оптическом микроскопе. Таковы были результаты детального изучения клеток регенерирую­щей конечности. Но на примере с резервными клет­ками планарий электронно-микроскопические данные не совпали с результатами, полученными ранее с по­мощью менее совершенной техники. В связи с этим иногда приходится подвергать повторному исследова­нию объекты, казалось бы, давно изученные, после чего нередко происходит пересмотр установленных в науке положений.

РИЧАРД ГОСС. РАЗНООБРАЗИЕ РЕГЕНЕРАЦИОННЫХ СИСТЕМ

Ричард Госс работает в Браунском университете го­рода Провиденс, штат Род-Айленд. Свою дгятель­ность он посвятил изучению проблемы регенерации различных органов у весьма широкого круга живот­ных. Мы приведем здесь лишь две его работы, характеризующие чрезвычайную широту его исследо­вательских интересов. Речь пойдет о регенерации вку­совых усиков (мелких бакенбардоподобных чувстви­тельных выростов, окружающих ротовое отверстие у представителей некоторых видов рыб) и крупных ветвящихся рогов у оленей и лосей, достигающих порой 130 сантиметров в длину.

Регенерация вкусовых усиков

Сом (по-английски «catfish», буквально «рыба-кошка») получил свое название именно благодаря чрезвычайно выраженным вкусовым усикам, очень напоминающим кошачьи усы. Д-р Госс обнаружил, что при отсечении у сома такого усика на его месте образуется бластема и утраченный отросток регене­рирует. При микроскопическом исследовании струк­тура усиков оказалась очень простой: каждый из них содержал нервы и кровеносные сосуды, основу органа составлял хрящевой стержень, а на верхушке под слоем эпидермиса находилась вкусовая почка.

Экспериментальное исследование этой миниатюр­ной регенерационной системы выявило ряд интерес­ных фактов. Бластема, образующаяся после отсече­ния усика, формировалась только из дедифференци­рованных клеток хряща. Если через небольшой разрез у основания усика удаляли хрящевой стер­жень, а затем пересекали и сам усик, бластема не формировалась и отросток не регенерировал. По­скольку хрящевой стержень оказался необходимым для регенерации усика, логично было предположить, что если в один усик поместить несколько стержней (можно до четырех), то после ампутации усика с пересечением всех стержней появляющийся отросток будет содержать столько стержней, сколько их было в культе. Но эксперимент выявил в регенерирующем усике только один стержень. По-видимому, бластема вкусового усика «запрограммирована» на формирова­ние нормального числа стержней в отростке, и при­сутствие дополнительных структур в культе не влияет на нормальный рост.

Регенерация рогов у оленей

В дальнейшем Госс сосредоточил свое внимание на изучении регенерации рогов у оленей. Периодическое естественное замещение этих структур являтся, по-видимому, единственным примером регенерации столь сложного органа у млекопитающих. Тем не менее он показывает, что и у теплокровных животных возмож­но восстановление крупных частей тела. Поэтому неудивителен большой интерес, проявляемый многими исследователями к изучению данной формы регене­рации. В силу этого общий характер роста и судьба тех или иных клеток при восстановлении оленьих рогов, а также факт гормональной зависимости про­цесса регенерации изучены достаточно хорошо. Гос­су, однако, удалось открыть в последнее время ряд новых способов воздействия природных сигналов на стимуляцию гормональной активности организма.

В ранний период роста у самцов оленя по обеим сторонам черепа, несколько выше и позади глаз, появляются небольшие костные выросты, или пеньки. Позднее на этих местах образуются мягкие округлые «роговые почки», которые затем удлиняются и вет­вятся. Рост и развитие рога происходит из верхнего его конца, но окостенение хрящевых клеток осуществ­ляется постепенно по мере удаления от основания рога снизу вверх. Подобный градиент дифференцировки тканей отмечается при каждом цикле регене­рации рогов.

У самцов оленей, живущих в зоне умеренного пояса, сбрасывание и отрастание рогов происходит ежегодно, причем у разных видов наблюдаются доволь­но существенные вариации как в размере рогов, так и в интенсивности процесса их восстановления. Госс составил таблицы, которые показывают, что у более крупных животных рост рогов идет быстрее. У лосей, самых крупных представителей семейства оленей, рога могут достигать в длину 129,5 сантиметра и расти со скоростью 2,75 сантиметра в день (рис. 41, А, Б). У всех оленей по мере окостенения растущего рога пронизывающие его кровеносные сосуды пере­крываются костной тканью, и кожа с короткими густыми волосами («вельвет»), покрывающая рога снаружи, лишаясь кровоснабжения, лопается и отпа­дает. Отпадение рогов, превратившихся в плотную компактную костную массу, происходит значительно позже, тогда, когда в месте соединения рогов и пеньков появляются клетки, разрушающие костные структуры. Ранки быстро заживают и рост рогов на­чинается заново. У большинства видов отпадение ро­гов происходит в конце зимы или весной, регенерацию можно видеть в летние месяцы, а сбрасывание «вель­вета» проходит как раз перед периодом размножения, то есть осенью. Все эти процессы приводятся в дви­жение зависящими от времени года колебаниями гормональной активности у оленей. Снижение коли­чества гормона тестостерона весной стимулирует отпадение рогов и начало регенерации, а повышение его уровня осенью приводит к постепенному окосте­нению рогов и потере «вельвета».

Рога лося и лани

Рога лося и лани

Если вы живете в средней полосе, вы знаете, что в разные времена года длина светового дня различ­на. Цикл роста рогов и изменений гормонального уровня у оленей связан непосредственно с сезонными изменениями длины светового дня. Госс создал в своих экспериментах режим искусственного освеще­ния, чтобы получить ответы на следующие вопросы; во-первых, можно ли изменить цикл смены рогов, удлиняя или укорачивая длительность искусствен­ного освещения, и, во-вторых, будет ли происходить замещение рогов в условиях, когда длина светового дня будет постоянной на протяжении всего кален­дарного года?

На первом этапе своих экспериментов он подвер­гал оленей воздействию «светового года» (полный годовой цикл возрастания и убывания длины свето­вого дня), который на шесть месяцев расходился по фазе с обычным годом, то есть зимой дни станови­лись длиннее, а летом — короче. Подопытных живот­ных (пятнистых оленей — небольших, легкого сложе­ния оленей, живущих в естественных условиях на Дальнем Востоке, но встречающихся в зоопарках всего мира) содержали в неотапливаемом помещении, где температура подвергалась естественным годовым изменениям. Специальный календарный механизм был соединен с осветительными приборами, с по­мощью которых поддерживалось «извращение вре­мен года»: осенью по мере падения температуры длина светового дня постепенно увеличивалась, тогда как весной с потеплением световой день сокра­щался. При содержании в таких условиях регенера­ция рогов у пятнистого оленя приходилась на зим­ние месяцы, а сбрасывание — на осень. Животные подверглись полной адаптации к извращенным усло­виям освещения, во всяком случае, в том, что каса­лось роста и регенерации рогов.

Стремясь всесторонне проверить свою гипотезу, Госс в следующих опытах подвергал животных воз­действию нескольких искусственных световых циклов на протяжении одного календарного года. Для этого календарный механизм настраивали так, чтобы он пропускал каждый второй день. Это обеспечило про­ведение за год двух годовых циклов изменения про­должительности светового дня. Если же механизм пропускал по два или три дня, годовые циклы повторялись трижды или четырежды в год. При по­мещении в такие условия пятнистые олени начинали терять рога дважды, трижды или четырежды в год в соответствии с числом экспериментальных годовых циклов. Из-за сокращения циклов длина отраставших рогов была, естественно, значительно меньше, чем при нормальном цикле (рис. 42, А, Б).

Задержка роста рогов у пятнистого оленя

Задержка роста рогов у пятнистого оленя

В следующем эксперименте Госс удлинил цикл светового года. Для этого календарный механизм дважды повторял каждый нормальный день, создав тем самым «двадцатичетырехмесячный год». Теперь ученый пытался получить ответ на следующие во­просы: продлится ли цикл роста рогов у содержа­щихся в таких условиях оленей все 24 месяца и ска­жется ли это на размерах рогов или нет? Ответ на первый вопрос оказался неодинаковым в опытах на оленях разного возраста: взрослые животные не изменяли цикла смены рогов, тогда как молодые олени легко приспосабливались к новой длительности «года», восстанавливая рога всего один раз за фак­тически два календарных года. Что же касается вто­рого вопроса, то ни разу не наблюдалось отрастания рогов, превышающих по длине нормальные, хотя аномалии в характере их роста иногда были. Но во всех случаях искусственного изменения времен года наблюдаемые биологические эффекты не носили по­стоянного характера: большинство оленей по возвра­щении к естественному содержанию восстанавливали обычную цикличность роста рогов.

Может ли какой-нибудь искусственно созданный световой режим полностью приостановить смену ро­гов? С этой целью экспериментатор вообще исключал какие-либо колебания в продолжительности светового дня. На протяжении ряда лет специальную группу оленей содержали в условиях смены света и темноты ровно через 12 часов. Подобные условия были иден­тичны тем, которые наблюдаются на экваторе. Свет включали в 6 часов утра и гасили в 6 часов вечера. В этой группе большинство оленей вообще утратили способность к смене рогов, их регенерационный цикл был полностью нарушен. Кроме того, было установ­лено, что утеря цикла связана с постоянно повышен­ным уровнем тестостерона.

И наконец, в последнем варианте опытов Госс воздействовал на группу оленей с помощью постоян­ных на протяжении календарного года циклов, состоя­щих из неравных периодов света и темноты: восемь, шестнадцать или двадцать четыре часа света сопро­вождались соответственно шестнадцатью, восемью часами темноты или свет не выключали вообще. В каждом таком случае искусственно удлиненных или укороченных световых дней животные оказались способны с достаточно большой точностью определять фактический ход времени. Они сменяли рога один раз в год и удивительно близко к срокам, когда этот процесс протекает в естественных условиях. Эти результаты дают веские основания предполагать, что оленям свойствен внутренний ритм типа «биологи­ческих часов». (В предыдущих опытах Госса такой ритм подвергался адаптационным изменениям при искусственных извращениях годовых циклов или пол­ностью нарушался при переводе животных в «эква­ториальные» условия освещения, когда свет и темно­та чередовались каждые 12 часов.) Каков бы ни был физиологический механизм наблюдаемого внутрен­него ритма, он зависит от главного фактора — нера­венства продолжительности светлых и темных перио­дов в каждом 24-часовом цикле.

Из результатов, полученных другими исследова­телями, вытекает, что тип реакции, наблюдаемой у оленей, не исключение. У большого круга животных физиологические изменения и приспособительные реакции тесно связаны со сменой дня и ночи, сменой времени года, чередованием приливов и отливов. Во многих случаях, когда животных извлекали из естественной среды обитания и лишали многочис­ленных ее «сигналов», они тем не менее сохраняли чувство времени и соответственно поддерживали свои нормальные биологические циклы.

Результаты опытов Госса по регенерации рогов у оленей позволяют предположить, что сходным обра­зом может осуществляться и регуляция других форм восстановительных процессов. Действительно, в по­следнее время наши знания о явлениях, относящихся к функционированию «биологических часов», непре­рывно расширяются. И по-видимому, недалек тот день, когда мы узнаем, каким образом приводится в движение этот удивительный часовой механизм природы.

Биологи, с которыми мы познакомились в этой главе, продолжают свои исследования по регенера­ции. Эллисон Бернетт в экспериментах на гидрах уточнил механизмы регуляции роста у этих кишечно­полостных животных. Кроме того, он пытается при­ложить некоторые из своих теорий к анализу регене­рации у позвоночных. Поскольку основные законо­мерности жизнедеятельности клеток у животных различных эволюционных групп чрезвычайно близки, естественно, что специалисты по росту и развитию какой-то одной группы животных стремятся распро­странить свои выводы на другие. Маркус Сингер, установив, что высвобождаемый нервной тканью фак­тор может влиять на клеточные механизмы синтеза белка несколькими путями, занялся поисками биохи­мической «мишени» этого вещества в клетках бласте­мы конечности. Среди многих аспектов нейробиологии, которыми он интенсивно занимается, его особое внимание привлекает изучение структуры и функций миелиновой оболочки аксонов. Что касается Элизабет Хей, то ее мастерство электронного микроскописта служит теперь уже не только задачам изучения ре­генерации. Она исследовала тонкую структуру самых разных эмбриональных клеток — в частности, клеток сердца и хрусталика куриного эмбриона — и сопоста­вила свои наблюдения с функциями этих клеток в процессе эмбрионального развития. Ричард Госс в настоящее время наибольшее внимание уделяет таким процессам компенсаторной регенерации, как восста­новление ткани печени и почки млекопитающих после удаления соответствующего органа. По мнению Гос­са, углубление знаний об этих процессах приведет к открытию специфических регуляторов роста тканей и органов у млекопитающих.

Работы этих ученых — и только что описанные, и осуществляемые ими в настоящее время — пред­ставляют, конечно, лишь часть той большой исследо­вательской деятельности, которая посвящена изуче­нию регенерационных процессов. Только вместе взятые, они могут дать целостную картину каждого конкретного процесса. Но в общем перспектива пред­ставляется обнадеживающей. Регенерация стала важ­ным разделом биологии развития — отрасли науки, занимающейся изучением закономерностей нормаль­ного и патологического роста, клеточной дифферен­цировки, экспериментальной эмбриологии и многими другими близкими проблемами. Благоприятные пер­спективы развития новой отрасли науки определя­ются еще и тем, что в последние годы в нее непре­рывно вливаются новые энтузиасты изучения реге­нерации.

comments powered by HyperComments