Sorry, this entry is only available in
Russian
На жаль, цей запис доступний тільки на
Russian.
К сожалению, эта запись доступна только на
Russian.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

Начнем опять с химической физики фотопроцессов, протекающих в нашем случае в фоторецепторной мем­бране зрительной клетки, Современные представления о первичных механизмах зрительной рецепции в норме и патологии немыслимы без привлечения физики и химии. Дадим некоторые основные сведения, без которых пони­мание материала будет затруднено.

Фотохимическая реакция протекает обычно в две стадии. Первичная фотохимическая реакция вследствие поглощения кванта света переводит молекулу В элек­тронно-возбужденное состояние. Во вторичных «темно­вых» реакциях принимают участие химические части­цы — молекулы, ионы, радикалы, которые образуются в ходе первичной фотохимической реакции.

Определяющая роль в химических превращениях при­надлежит электрону. В атоме состояние электрона одно­значно охарактеризовано, если известна его атомная орбиталь и спиновое квантовое число (электрон можно себе представить вращающимся вокруг оси). Величина спина, т. е. момент количества движения, одинакова для всех электронов, но ориентация оси может меняться. Свободный электрон может ориентироваться только в одном из двух направлений: параллельно данному полю, например направлению магнитного поля Земли, или антипараллельно, т. е. иметь противоположную ориента­цию. Следовательно, поскольку возможны только две независимые различные ориентации спина, то им в кван­товой физике приписывают два различных значения спи­нового квантового числа: ms = — 1/2 и ms = + 1/2.

Для рассмотрения с позиций химической физики фо­топроцессов в клетках и тканях глаза требуется пони­мание этих азов современной физики. Иначе многие тер­мины, которые все чаще появляются в научных статьях о зрении и которыми мы будем пользоваться, останутся непонятными.

Согласно одному из основных положений квантовой механики — принципу Паули два электрона не могут находиться в одинаковом состоянии, следовательно на одной атомной орбитали не может находиться более двух электронов. Далее, эти два электрона на одной атомной орбитали имеют противоположно ориентированные (ан­типараллельные) спины; их называют спаренными элек­тронами. Если на какой-либо атомной орбитали нахо­дится один электрон, то его называют неспаренным электроном. Частицы, имеющие неспаренные электро­ны, — это и есть свободные атомы и свободные радика­лы, обладающие высокой реакционной способностью. Метод электронного парамагнитного резонанса позво­ляет их регистрировать.

Состояние отдельных электронов определяет энерге­тическое состояние атома или молекулы. Состояние с наименьшей энергией называют в физике основным, остальные состояния — возбужденными. Основное со­стояние — это начальное состояние невозбужденного атома или молекулы. В темноте 11-цисизомерная форма ретиналя, ковалентно (Ковалентная химическая связь осуществляется парой электронов, находящихся в общем владении двух атомов, образу­ющих связь) связанная с лизиновым остатком белковой части молекулы родопсина, находится в основ­ном состоянии. При поглощении кванта света атом или молекула переходят в так называемое возбужденное синглетное состояние. Может быть несколько синглет­ных состояний: нижнее и несколько высших. Во всех этих состояниях спины электронов все еще антипараллельны. Большинство первичных фотохимических реак­ций происходит в нижнем возбужденном синглетном со­стоянии.

Далее атом или молекула из нижнего синглетного состояния переходят в нижнее триплетное состояние. В триплетном состоянии в отличие от синглетного спи­ны электронов становятся параллельными. В триплет­ном (возбужденном) состоянии молекулы имеют два неспаренных электрона, т. е. две свободные валентности, — такие состояния называют бирадикальнымиБирадикальные состояния молекул имеют значительно большую продолжительность жизни, чем обычные синглетные воз­бужденные состояния (в некоторых случаях до 1 с). Об­ладая избыточной энергией и имея еще две свободные валентности, молекулы в триплетном электронно-воз­бужденном состоянии еще более реакционноспособны, чем обычные возбужденные молекулы.

При этих условиях электронная конфигурация моле­кулы кислорода имеет в основном (невозбужденном) со­стоянии два неспаренных электрона и, значит, кисло­род обладает парамагнитными свойствами. Фактически молекулярный кислород представляет собой бирадикал, поэтому он хорошо реагирует с другими свободными ра­дикалами; однако с молекулами, у которых все электро­ны спарены, кислород, к счастью, реагирует с трудом. Антипараллельные спины двух электронов не позволяют одному из них покинуть орбиталь и спариться с неспа-ренными электронами триплетного невозбужденного кислорода. Мы не случайно употребили слово «к сча­стью», говоря об устойчивости молекулы кислорода в обычном, триплетном состоянии. В противном случае жизнь на Земле вряд ли была бы возможна: все живое быстро окислилось бы, сгорело в атмосфере молекуляр­ного триплетного кислорода.

Однако вернемся к фотохимии и к ретиналю. По­глотив квант света, 11-цисретиналь в родопсине перехо­дит в электронно-возбужденное состояние. Атом или мо­лекула, находящиеся в возбужденном электронном со­стоянии (синглетном), живут недолго. Это связано с фи­зическими процессами дезактивации. Один из них — испускание излучения, или люминесценция.

Другой путь дезактивации молекулы: одно электрон­но-возбужденное состояние может переходить в дру­гое без поглощения или испускания света — безызлуча­тельные процессы. Направление спинов электронов при этом или не меняется (внутренняя конверсия — синглет­синглетный или триплет-триплетный переходы) или ме­няется (интеркомбинационная конверсия — синглет­триплетные или триплет-синглетные переходы). Время этих переходов крайне мало — миллиардные доли се­кунды.

Почему мы вынуждены погружаться в эти тонкости фотофизики? Потому что закономерности первичных стадий фотохимических реакций, в том числе и в зри­тельных пигментах, естественно, едины для всех без исключения и фотохимических, и фотобиологических яв­лений.

Как показали последние работы с применением сверх­коротких лазерных импульсов, время первичной фото­химической реакции в зрении (время изомеризации 11-цисретиналя в молекуле родопсина) порядка одной пи­косекунды (10-12 с) или даже согласно некоторым ра­счетам 0,1—0,3 пс. Фотохимический механизм этих истинно мгновенных реакций в зрении окончательно не­выяснен. В настоящее время это «горячая точка» в фо­тохимии зрительных пигментов.

Подчиняясь общим законам фотохимии, фотоизоме­ризация ретиналя в молекуле родопсина имеет особен­ности, принципиально важные для осуществления зрительного акта. Ретиналь, или альдегид витамина А, — не что иное, как половина молекулы β-каротина, кото­рого так много в моркови. Каротиноиды — один из са­мых распространенных классов естественных пигментоз в растительном и животном царствах. Характерная осо­бенность этих соединений — их полиеновая структура, т. е. Чередование двойных углерод-углеродистых связей. Чем длиннее полиеновая цепочка, тем дальше в крас­ную область видимого спектра сдвинут у них максимум спектра поглощения. Свободный ретиналь с короткой по сравнению с другими каротиноидами цепочкой по­глощает в ближней ультрафиолетовой области (380 нм), однако в Составе Молекулы родопсина ретиналь погло­щает в видимой области. Природа огромного красного смещения (например, в палочках сетчатки лягушки, бы­ка или человека от 380 до 500 нм) окончательно не вы­яснена. Это одна из интереснейших областей молеку­лярной спектроскопии зрительных пигментов. Главное здесь — уяснить роль белкового окружения в формиро­вании спектральных характеристик ретиналя.

Другая поразительная особенность поведения рети­наля в молекуле зрительного пигмента — высокая ско­рость перехода из 11-цис в трансформу. Большинство фотоизомеризаций обратимо, т. е. вслед за цис —» транс возможен обратный транс —» цис-переход. При низких температурахфотоизомеризация идет хорошо. Цисизо­мерных форм может быть много (в природе найдено шесть изомерных форм ретиналя), но переходить из од­ной в другую они могут только через общий промежу­точный продукт (в случае ретиналя через полностью трансизомер). По нашим данным, несколько раз и всего за несколько наносекунд (1 нс = 10~9 с) ретиналь в со­ставе молекулы родопсина способен переходить при ком­натной температуре из цис в транс и из транс в цисизо­мерные формы.

Поглотившие световой квант цис- или трансизомеры переходят из основного невозбужденного в электронно-возбужденное синглетное состояние. Затем наряду с фи­зическими процессами дезактивации синглетного состоя­ния возможен переход в триплетное электронно-возбужденноесостояние. Хотя изомеризация — это из­менение пространственного расположения атомов в мо­лекуле, вращение атомов, соединенных в молекуле двой­ными связями, крайне затруднено. Вместе с тем поворот в молекуле происходит как раз по двойным связям между атомами углерода. Почему так? Дело в том, что в электронно-возбужденных состояниях между атомами углерода имеется практически лишь простая (не двой­ная) связь, поэтому вокруг этой связи и возможно вра­щение. В возбужденном триплетном состоянии из транс­триплета может образоваться цистриплет, и наоборот.

Обычно цис-триплетное состояние имеет более высо­кую энергию, чем транстриплетное. Поэтому цис-транс-­переход происходит достаточно легко и его квантовый выход не зависит от температуры.

Зная эти закономерности фотоизомеризационных пре­вращений, становится понятнее, почему в ходе биологи­ческой эволюции именно 11-цисретиналь в изогнутой, скрученной и наименее геометрически вероятной форме сохранился в качестве хромофорной группы зрительных пигментов всех позвоночных животных и беспозвоноч­ных — моллюсков, ракообразных, насекомых. Даже у эволюционно древних солелюбивых бактерий, галобак­терий, находящихся на слепой ветви эволюции, совер­шенно независимо в качестве светочувствительной рецепторной молекулы сформировался похожий на зритель­ный родопсин ретинальсодержащий мембранный белок, ответственный за движение бактерий от света (фото­таксис).

Удачно найденное спектроскопическое и фотохими­ческое решение проблемы светочувствительных рецеп­торных белков сохранилось в эволюции практически не­изменным, вероятно, благодаря их следующим замеча­тельным качествам. Родопсин — одно из наиболее ин­тенсивно окрашенных соединений, известных в органи­ческой химии. У него также исключительный спектр по­глощения (80—100 нм — полуширина спектра). Все это позволяет зрительному пигменту согласно требованию первого закона фотохимии эффективно поглощать кван­ты света в достаточно широкой области видимого спект­ра. Вероятность поглощения квантов света у родопсина приближается к теоретически возможному. Еще одно важное свойство — положение максимума спектра по­глощения 11-цисретиналя сдвигается в зависимости от вариации белковой структуры у разных видов живот­ных в огромном спектральном диапазоне — от 330 до 700 нм. Благодаря этой замечательной способности зре­ние животных приспособлено к разным средам обитания — от морских глубин до воздушного океана. С по­зиций молекулярной спектроскопии, биоорганической хи­мии и генетики это явление еще ждет своего объяснения. И наконец, кардинальное фотохимическое свойство зри­тельных пигментов — квантовый выход фотоизомериза­ции 11-цисизомера ретиналя самый высокий — 0,7, у всех других изомеров он ниже. Иными словами, это са­мый светочувствительный изомер, отобранный в ходе эволюции в качестве хромофорной группы зрительных пигментов.

Основные сведения о фотохимических превращениях родопсина, о первичной фотохимической реакции его хромофора, о кинетике появления и распада проме­жуточных продуктов его обесцвечивания (фотолиза) бы­ли получены с помощью методов низкотемпературной спектрофотометрии. При температуре жидкого азота и даже гелия (вблизи абсолютного нуля) освещение ро­допсина приводит к появлению первого продукта — ба­тородопсина, максимум спектра поглощения которого сдвинут еще дальше в красную область на 50 нм. В ба­тородопсине ретиналь оказывается уже не в 11-цис-, а в полностью трансформе. Следовательно, даже при столь низкой температуре, но с тем же квантовым выходом происходит реакция фотоизомеризации. Как следует из общих закономерностей реакции цис-транс-фотоизоме­ризации, в этом ничего удивительного нет — цис-транс-­переходы от температуры не зависят.

Совокупность большого числа работ позволила аме­риканскому исследователю зрительных пигментов Дж. Уолду в своей нобелевской речи в 1968 г. канони­зировать положение о фотоизомеризации ретиналя как первой и единственной фотохимической реакции в зри­тельном процессе. Однако в середине 70-х годов возник­ли сомнения по этому поводу. Новая лазерная техника, позволявшая достичь сверхкоротких вспышек в нано-и пикосекундном интервалах, была применена для ис­следования фотохимии родопсина. Первые же работы дали поразительные результаты: при комнатной темпе­ратуре время образования батоформы родопсина оказа­лось меньшим 3—6 пс. Столь быстрая кинетика цис-транс-перехода ретиналя в родопсине показалась неве­роятной. В свободном, с белком не связанном состоянии ретиналь способен изомеризоваться со скоростью, в 102—103 раз меньшей. Во многих лабораториях начались интенсивные исследования фотопревращений ро­допсина как при низкой, так и при комнатной темпера­турах. В результате этих работ сейчас складывается впечатление, что первоначальная точка зрения о фото­изомеризации ретиналя как первой фотохимической ре­акции в зрении справедлива. Становится очевидным, что белковое окружение играет решающую роль в облегче­нии и ускорении фотоизомеризации — пикосекундная изомеризация ретиналя возможна в белковой макромо­лекуле, но в растворе невозможна.

Белок помогает ретиналю быстро переходить не толь­ко из цис- в трансформу, но и обратно. Этот обратный процесс называется фоторегенерацией. У беспозвоноч­ных это главный путь восстановления родопсина после его обесцвечивания в зрительных клетках. У позвоноч­ных основной путь регенерации зрительного пигмента— «темновой»: трансретиналь отщепляется от белка и ухо­дит в пигментный эпителий, а на его место из пигмент­ного же эпителия доставляется новый ретиналь, но уже в 11-цисформе. Только он способен соединиться с бел­ком и образовать обновленную молекулу родопсина. Однако процесс фоторегенерации хорошо идет и в ро­допсине позвоночных животных (быка, лягушки). Как было показано нами, при температуре около —20°С в замороженном дигитониновом экстракте родопсина при поглощении «второго» кванта света один из промежу­точных продуктов фотолиза — метародопсин I с лег­костью переходит снова в родопсин. Существенно, что при этом должна происходить не только изомеризация ретиналя, но (и это совершенно необходимое условие!) белок должен возвращаться в исходное конформацион­ное состояние. В противном случае образовавшийся 11-цисретиналь неспособен был бы войти в положенное ему хромофорное место белка, как ключ не может вой­ти в чужой или сломанный замок.

В последние годы была выполнена серия работ, в которых четко установлено, что в ходе фотопревраще­ний родопсина вслед за фотоизомеризацией ретиналя происходят существенные перестройки и в белковой ча­сти молекулы. Даже при температуре жидкого азота в ходе прямой и обратной фотохимических реакций ро­допсина в мембране наблюдаются обратимые изменения в хромофорном окружении. На последующих стадиях фотолиза эти изменения становятся столь значительными, что их удается наблюдать с помощью так называе­мых спиновых меток. (Метод «спиновых меток и зон­дов» был разработан и успешно применен в Институте химической физики для исследований конформационных изменений в макромолекулах, в первую очередь в ну­клеиновых кислотах и белках.)

«Разворачивание» белковой структуры проявилось особенно наглядно в опытах с определением высокореак­тивных сульфигидрильных групп белка, доступных для химических реагентов. Оказалось, что к двум «темновым» SH-группам, т. е. доступным для SH-реагентов в темноте, после обесцвечивания добавляются еще четы­ре. В необесцвеченном зрительном пигменте они были спрятаны, недоступны; в результате разворачивания бел­ковой структуры они как бы раскрылись. Белковая часть молекулы родопсина должна затем как-то вновь свернуться, возвратиться в исходное конформационное состояние. Иначе доставленный специальными белка­ми-переносчиками 11-цисретиналь, встретив в зри­тельной клетке «развороченный замок», неспособен был бы в него войти, т. е. нормальная регенерация родопси­на стала бы невозможной. В условиях физиологических освещенностей это означало бы, что, один раз взглянув на солнечный мир, мы бы ослепли — светочувствитель­ное вещество (родопсин) не восстановилось бы, как не­способна восстановить свою светочувствительность за­свеченная пленка в фотоаппарате.

Итак, основной вывод, который следует из работ по­следнего времени, сводится к следующему: первое фо­тохимическое событие в зрении — действительно фото­изомеризация 11-цисретиналя. Эта реакция совершается быстрее пикосекунды, и ближайшее белковое окружение хромофора принимает в этом сверхбыстром изменении конфигурации ретиналя непосредственное участие; в растворе такая высокая скорость изомеризации ретина­ля невозможна. Однократного «срабатывания» свето­чувствительной макромолекулы оказывается достаточ­но для возникновения фоторецепторного сигнала. По­следовательность событий в молекуле родопсина соглас­но современным представлениям такова: родопсин (500)

полностью трансретиналь + опсин (в скобках даны максимумы спектров поглощения родопсина и продуктов его фото­лиза в нанометрах).

На всех стадиях, даже на первой происходят кон­формационные перестройки в белковой части. Поглотив квант света, молекула родопсина переходит в более вы­сокое энергетическое состояние; энергия, заключенная в напряженной конформацин первого продукта фотоли­за — батородопсине, затем диссипирует — растрачивает­ся. Наибольшие конформационные перестройки белко­вой части наблюдаются на стадии перехода метародоп­сина I в метародопсин II, Именно на этой стадии моле­кула поглотившего свет родопсина, взаимодействуя в фоторецепторной мембране с другими белками-фермен­тами, активирует их.

Как установлено в последнее время, обесцвеченная молекула родопсина запускает сложную цепь фермента­тивных реакций в зрительной клетке — ферментатив­ный каскад усиления (своего рода цепную разветвлен­ную реакцию на уровне клетки) слабого светового сиг­нала. Обесцвечивание родопсина связано также с повы­шением проницаемости фоторецепторной мембраны. Фо­тоизомеризация ретиналя и вызванные вследствие это­го конформационные изменения белка сопровождаются быстрыми электрическими процессами.

Отличительная черта фотобиологических процессов (фотосинтеза и фоторецепции) — высокоэффективное преобразование световой энергии. В случае фотоэнер­гетического процесса (фотосинтеза) в так называемых реакционных центрах поглощенная световая энергия преобразуется в энергию электрических зарядов. Иными словами, основная функция реакционного центра (ма­кромолекулярного хлорофиллсодержащего комплекса) — это перенос электронов через мембрану. Разделение электрических зарядов на самых первых этапах фото­синтеза происходит также быстро, как и фотоизомери­зация 11-цисретиналя в зрении, т. е. за пикосекунды. Вслед за разделением электрических зарядов соверша­ются, как и после фотоизомеризации ретиналя в родоп­сине, структурные, конформационные, перестройки в белковой части фотосинтетического реакционного цент­ра. Таким образом, осуществляется следующая последовательность: свет —» электронно-возбужденное состоя­ние хромофора в макромолекулярном реакционном цент­ре —» трансмембранное разделение электрических заря­дов —» конформационные перестройки белкового окру­жения. Все это — основные физико-химические события на первых стадиях фотосинтеза.

Наиболее простой системой преобразования и запа­сания световой энергии оказался бактериородопсин в пурпурной мембране бактерий, живущих в очень соле­ных озерах. Он похож на зрительный родопсин, посколь­ку также содержит хромофорную группу ретиналь (толь­ко не в 11, а 13-цис или полностью трансизомерной фор­мы), тоже представляет собой трансмембранный белок и тоже светочувствителен. Только функция у него фото­энергетическая, он преобразует и запасает энергию све­та в форме электрохимической разности электрических потенциалов ионов водорода. Бактериородопсин — это светочувствительный насос, перекачивающий ионы во­дорода через пурпурную мембрану против градиента их концентраций. Первичная фотореакция в бактериоро­допсине — изомеризация ретиналя и его переход на све­ту из транс- в 13-цисизомерную форму. В свою очередь, перестройка ретиналя затрагивает его ближайшее бел­ковое микроокружение. Уже на первых стадиях бакте­риородопсинового фотоцикла за пикосекундные време­на происходит смещение электронной плотности и затем активный с затратой запасенной энергии перенос прото­на через мембрану.

В конечном счете в результате поглощения света бактериородопсином на пурпурной мембране создается электрохимический градиент ионов водорода. В фото­биоэнергетических процессах главное (в результате пе­реноса электронов или протонов) — создать трансмем­бранную разность электрохимических потенциалов ионов водорода, служащих в нормальных условиях источником энергии для синтеза АТФ.

Основное отличие фотоинформационного процесса со­стоит в том, что молекула зрительного пигмента сраба­тывает однократно. У позвоночных животных и челове­ка ретиналь в трансформе отщепляется от белка. У бес­позвоночных ретиналь хотя и не отщепляется, но следу­ющий квант света, поглощенный таким неоторвавшим­ся от белка трансретиналем, не запускает обычной цели внутриклеточных процессов, приводящих к возникнове­нию фоторецепторного сигнала. Обесцвеченная, конфор­мационно измененная молекула, время жизни которой в таком состоянии достаточно велико, инициирует каскад последующих ферментативных и ионных процессов в зрительной клетке.

В фотоэнергетических процессах и хлорофиллсодер­жащий реакционный центр, и бактериородопсин (бес­хлорофилльный, вероятно, очень древний вид фотосинте­за) работают обратимо, циклично. В фотосинтетической или пурпурной бактериальной мембране на один реак­ционный центр или одну бактериородопсиновую молеку­лу приходится 50—100 квантов в 1 с. В то же время в условиях полной темновой адаптации одна палочка в ответ на очень слабую вспышку света поглощает со­гласно расчетам всего 1 квант в 40 мин.

Таким образом, становятся очевидными общность и различие основных фотобиологических процессов — фо­тосинтеза и фоторецепции. Общность следует из фото­химической природы первичных процессов. В обеих си­стемах имеется специальная хромофорная молекула, ко­торая поглощает квант света и переходит в электронно-возбужденное состояние. Запасенная энергия кванта ис­пользуется для изменения конформации, для структур­ной перестройки белковой части хромофор-белкового макромолекулярного комплекса. Для фотоинформаци­онного процесса этого однократного события достаточ­но: квант света спускает курок — фотоизомеризует 11-цисретиналь, и заряженное ружье — сложная иерархи­ческая система в зрительной клетке (молекула родопси­на —» молекулы других белков —» фоторецепторная мембрана —» цитоплазма —» поверхностная клеточная мембрана) — выстреливает, т. е. возникает фоторецеп­торный (электрический) нервный сигнал.

Фотосинтез — запасание солнечной энергии в виде энергии химических связей — возможен только благо­даря многократному повторению циклов работы свето­чувствительных макромолекулярных хромофор-белковых комплексов, На первых этапах фотосинтеза энергия по­глощенных квантов света запасается в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мем­бране, чтобы затем на более длительное время запа­стись в виде богатых энергией химических связей в мо­лекуле АТФ и далее навсегда законсервироваться в углеводе (сахаре) согласно валовому уравнению фотосинтеза в зеленом листе: 6СО2 + 6Н2О —»(свет) С6Н2О6 + 6О2.

Итак, фотоизомеризация 11-цисретиналя — первая, внутримолекулярная реакция в зрительном процессе. Вместе с тем фотовозбужденный ретиналь может ини­циировать и евободнорадикальное фотосенсибилизиро­ванное окисление, Что должно вести к деструкции фото-рецепторноймембраны. Проблема фотоповреждения зрительной клетки стала предметом экспериментально­го изучения лишь сравнительно недавно, хотя в фото­синтетическом аппарате она исследована подробно. 3 обоих случаях те же хромофоры, которые обеспечива­ют фотоинформационный и фотоэнергетический процес­сы, оказываются и фотосенсибилизаторами, способными вызвать активацию молекулярного кислорода С перево­дом его в химически активную форму — в форму син­глетного возбужденного состояния. Поэтому и в фото­рецепторной и в фотосинтетической клетках сформиро­валась мощная система антиокислительной защиты. В фотосинтезе защита от фотодеструкции осуществля­ется с помощью механизма перехвата энергии возбуж­денного (триплетного) состояния хромофора каротино­идами. В зрительной клетке существует несколько звень­ев антиокислительной защиты; главное звено — а-токоферол, или витамин Е, мощный биоантиоксидант.

Такова диалектическая природа фотобиологических процессов, свет необходим для ее осуществления, но он же опасен: свет надо эффективно использовать и от него же приходится защищаться.