2 years ago
No comment

Sorry, this entry is only available in
Russian
На жаль, цей запис доступний тільки на
Russian.
К сожалению, эта запись доступна только на
Russian.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

  1. Контроль трансляции

Каждый непредубежденный «трансляционист», так же как и я, скоро оказывается перед необходимостью объ­яснить, каким образом в цитоплазме происходит регуляция синтеза белка. Меня всегда смущает мысль, что, хотя сей­час вполне доказано существование цитоплазматической регуяции синтеза белка, я не могу привести достаточно серьезных экспериментальных данных о химической при­роде такой регуляции. Вероятно, это происходит по двум причинам. Во-первых, на разработку и проверку моделей регуляции, действующей на уровне генов, было затрачено гораздо больше усилий, чем на исследование цитоплазма­тической регуляции. Во-вторых, многие аспекты синтеза белка мы все еще представляем себе очень туманно и схе­матично. Например, почти в любом учебнике часто можно встретить рисунок, где изображены рибосомы, двигающие­ся вдоль нити РНК-посредника и выполняющие, таким образом, роль «считывающего» механизма [1]. Но, как я уже говорил в гл. III, едва ли возможно существование в цитоплазме нормальной клетки подобных нитей, и мне не удалось найти убедительных данных, подтверждающих, что рибосомы на самом деле скользят вдоль таких нитей. Напротив, при исследовании как интактных клеток, так и бесклеточной системы получены данные, которые делают эту схему еще более сомнительной.

В некоторых клетках, особенно в тех, которые синтези­руют и секретируют большие количества специализирован­ных белков, рибосомы присоединены к мембранам хорошо развитой эндоплазматической сети, причем прикреплены настолько прочно, что их удается отделить, только приме­нив крайние меры, как, например, растворив клеточную мембрану. Рибосомы располагаются в ряд на одной из по­верхностей мембраны, иногда прилегая друг к другу вплотную, совсем как тесно пришитые пуговицы (фото II, А и Б). Было показано, что синтез белка в цитоплазме та­ких клеток действительно происходит в основном на рибо­сомах, присоединенных к мембране [2]. Но ни расположе­ние этих рибосом на мембране, ни прочность их прикреп­ления к ней не дают нам оснований считать, что они скользят вдоль гипотетических линейных нитей. Более того, в бесклеточной системе, где синтез полипептидов определяется добавляемыми искусственными полинуклеотидами, та небольшая фракция полинуклеотидов, которая используется в качестве матриц, прочно связывается с рибосомами, причем связывается таким образом, что ока­зывается защищенной от действия рибонуклеаз, всегда находящихся в большом количестве в препаратах разру­шенных клеток [3].

Эндоплазматическая сеть...

Эндоплазматическая сеть…

Эти данные едва ли подтверждают представление о том, что в бесклеточной системе рибосомы скользят вдоль незащищенной вытянутой нити или (в сущности это одно и то же) что эта нить двигается вдоль ряда неподвижных рибосом.

Я говорю о подобных трудностях вовсе не для того, что­бы еще и еще раз подчеркнуть, как мало обоснованы неко­торые современные воззрения, но для того, чтобы показать, как сложно предложить какую-либо конкретную модель регуляции белкового синтеза, если мы не имеем четкой пространственной картины синтеза белка. В настоящее время обсуждаются две основные модели цитоплазматической регуляции. В одной из них предполагается существо­вание особых форм транспортной РНК, тогда как другая основана на изменении конформации частично синтезиро­ванного белка. Мысль о том, что трансляция может регу­лироваться особыми формами транспортных РНК, впервые, по-видимому, была высказана Эймсом и Гартманом [4], когда они пытались объяснить поведение мутантов Salmonella с полярной мутацией в гистидиновом локусе. У таких мутантов мутация в каком-либо из генов, состав­ляющих тесно сцепленную группу и ответственных за синтез гистидина, характерным образом влияет на ско­рость синтеза ферментов, контролируемых соседними гена­ми этого локуса: задеты бывают только те гены, которые расположены дистально (в направлении транскрипции ДНК) по отношению к мутантному локусу, причем чем дальше от мутантного находится данный ген, тем меньше синтезируется фермента, контролируемого этим геном.

Эймс и Гартман предположили, что есть особые семей­ства транспортных РНК («переключающие» транспортные РНК), которые, помимо выполнения своей основной ро­ли — присоединения аминокислот, — способны ограничи­вать скорость трансляции матричных РНК. Думали, что «переключающие» транспортные РНК могут снимать рибосомы с нити РНК-посредника или препятствовать движению активной рибосомы вдоль нити, вытесняя тем самым все последующие рибосомы. За это время свободный дистальный конец нити может разрушиться, и вероятность его трансляции в результате оказывается сниженной.

Позже эту схему разрабатывали другие исследователи, и были предложены более конкретные модели, где «пере­ключающие» транспортные РНК или «аналоги транспорт­ных РНК» играют главную роль в механизме, управляю­щем скоростью синтеза белков [5]. Но мне кажется, что объяснять регуляцию синтеза белка с помощью статисти­ческих понятий, в частности рассматривать вероятность снятия рибосомы с нити матричной РНК [4], — это значит выдвигать гипотезу, слишком уж мало связанную с имею­щимися экспериментальными данными. И если эта мо­дель, кроме того, осложняется предположением об изби­рательном разрушении только одного конца нити, то перед нами вновь встают те же трудности, о которых я упоминал в связи с попыткой объяснить регуляцию синтеза белка избирательным разрушением матриц.

Известно, что у грамотрицательных бактерий для реп­рессии биосинтеза гистидина и валина иногда необходимо образование комплексов гистидил- и валил-тРНК [6—10], но в случае фенилаланина и тирозина это, по-видимому, не так [11, 12]. Тщательное изучение биосинтеза аргинина показало, что комплексы аргинил-тРНК (по крайней мере, большая часть их) не участвуют в репрессии биосинтеза этой аминокислоты [13, 14]. Слабое место всех моделей регуляции, в которых предполагается участие особых мо­лекул транспортных РНК, состоит prima facie в том, что для осуществления регуляции необходимо множество таких молекул. Если главный механизм регуляции основан на переключении синтезов с помощью транспортных РНК, то число «переключающих» молекул, казалось бы, должно быть примерно равно числу матриц или превышать его. Нам же неизвестно, сколько разных типов молекул тран­спортных РНК требуется для осуществления регуляции, если исходить даже из простейшей модели регуляции это­го процесса. Стент указывал, что это возражение можно было бы обойти, если бы в самой матрице для узнавания и присоединения «переключающей» транспортной РНК вместо триплетов нуклеотидов имелись секступлеты или если бы в присоединении этой РНК участвовали одновре­менно два разных триплета. Всем ясно, что можно приду­мать множество способов обойти эту трудность, но все они слишком умозрительны и совсем лишены эксперименталь­ного подтверждения.

Меня всегда привлекала мысль, что регуляция синтеза белка должна осуществляться с помощью механизмов, которые действуют именно там, где происходит сам синтез, и что специфичность этих механизмов определяется уни­кальной способностью белков с высокой степенью точности узнавать другие (как большие, так и малые) молекулы. Именно поэтому наиболее приемлемыми мне кажутся схе­мы, основанные на способности белков к узнаванию. Самая простая из них была предложена впервые Фогелем более десяти лет назад [15]. Согласно этой модели, регуляторные механизмы контролируют процесс отделения полипептидов от матриц, на которых они синтезируются. Легко предста­вить себе, что скорость снятия полипептидов с матриц может регулироваться, и, действительно, это подтвержда­ется целым рядом фактов. Однако любая обобщающая модель должна удовлетворять основному требованию, предъявляемому к таким моделям: учитывать строгую специфичность регуляции и объяснять, например, как про­дукты обмена углеводов подавляют синтез ß-галактозидазы у Е. coli или как наличие гема регулирует синтез глобина в ретикулоцитах.

Требование специфичности в данном случае означает, что молекула, осуществляющая регуляцию, и полипептид, скорость синтеза которого она регулирует, должны узна­вать друг друга еще тогда, когда полипептид тем или иным способом прекреплен к матрице. Если для отделения какой-то части полипептида от матрицы необходимо, чтобы синтезировалась вся молекула целиком, то остается непо­нятным, каким образом может происходить такое взаимное узнавание: ведь стерическая специфичность белковых мо­лекул непосредственно связана с их пространственной конфигурацией. Поэтому следует рассмотреть другую воз­можность: полипептид отделяется от матрицы по мере того, как идет его синтез, и освободившаяся часть приобре­тает характерную пространственную конфигурацию еще до того, как будет готова вся полипептидная цепь. Таким образом полипептид, еще не полностью отделившись от матрицы, может принять форму, способную узнавать дру­гие молекулы. Можно предположить далее, что при взаи­модействии частично синтезированной полипептидной це­пи с узнающей ее молекулой прекращается дальнейшее свертывание полипептида и отделение его от матрицы [16].

Исследования третичной структуры лизоцима, прове­денные сравнительно недавно, подтвердили правомерность такой модели [5]. Структура этого фермента дает нам до­статочно веские основания считать, что свертывание по­липептидной цепи действительно происходит по мере ее синтеза и что конфигурация освободившейся начальной части молекулы может определять ход дальнейшего свер­тывания всей остальной молекулы. Кроме того, ингибитор, присоединяясь к ферменту, вызывает изменение формы его молекулы, поэтому весьма вероятно, что ингибитор специфически связывается с частично синтезированным белком и этим препятствует его дальнейшему отделению от матрицы.

Итак, можно представить, что синтез белка регулирует­ся соотношением числа свободных и связанных молекул ингибитора: когда в клетке возрастает концентрация моле­кул ингибитора, растет частота их связывания с не пол­ностью синтезированными молекулами белка, в результате чего синтез белка подавляется, когда же концентрация ингибитора уменьшается, синтез восстанавливается. Это не просто предположение. Имеется множество данных, свиде­тельствующих о том, что молекулы белка участвуют в ре­гуляции собственного синтеза [17]. Так, описаны случаи, когда мутация, затрагивающая область фермента, ответст­венную за регуляцию конечным продуктом, одновременно влияет на репрессибельность синтеза этого же фермента [18, 19]. Известно также, что некоторые мутации структур­ного гена нарушают не только каталитическую активность фермента, но и его индуцибельность или репрессибель­ность [20, 21]. Эти наблюдения трудно объяснить, исходя только из того, что агент, ответственный за репрессию син­теза, каким-то образом взаимодействует с самим синтези­руемым ферментом. Модели, основанные на подобном взаимодействии еще недостроенной полипептидной цепи, допускают возможность как непосредственной регуляции малыми молекулами, так и опосредованной — с участием других белков. Тогда регуляция синтеза какого-нибудь фермента могла бы осуществляться либо посредством пря­мого взаимодействия этого фермента с субстратом или конечным продуктом, либо посредством его взаимодействия с каким-то другим белком, способным узнать частично синтезированный фермент, а значит, и присоединяться к нему.

Однако при сравнительном изучении индукции многих ферментов у самых разных организмов оказалось, что продолжительность лаг-периода, предшествующего инду­цированному синтезу, очень варьирует. Поэтому следует постулировать существование механизмов, позволяющих метаболиту регулировать синтез соответствующего фер­мента, не только непосредственно соединяясь с частично синтезированным белком, но и каким-то другим косвенным путем. Так, лаг-период при индукции синтеза ß-галактози­дазы у Е. coli составляет 2—3 мин [22], при индукции ацетилорнитинтрансаминазы — примерно 8 мин [23], а при индукции пенициллиназы В. cereus — 10—15 мин [24]. У жи­вотных клеток лаг-период обычно измеряется часами. И если в одних случаях можно предположить, что по край­ней мере часть этого периода составляет время, необходи­мое для установления соответствующей концентрации ме­таболита внутри клетки, то в других случаях такое объ­яснение не годится.

Взаимодействие между метаболитом и узнающим его белком должно происходить фактически без задержки, а, следовательно, там, где, несмотря на соответствующую концентрацию метаболита, все же имеется лаг-период, синтез белка, очевидно, контролируется более сложной цепью событий.

  1. Контроль транскрипции

Перейдем теперь к обсуждению генетической регуляции в собственном смысле этого слова, т. е. регуляции первич­ной активности генов — синтезу РНК на ДНК. Б принципе транскрипция ДНК может регулироваться двумя способа­ми: изменением скорости считывания какого-либо одного гена или же изменением числа активных генов. Не исклю­чено, конечно, что меньшая скорость транскрипции одних генов по сравнению со скоростью транскрипции дру­гих зависит от их внутренней структуры. Если бы это было так, то вся регуляция сводилась бы к различиям в скорости транскрипции, обусловленным особенностями внутренней структуры генов. Такая точка зрения до сих пор ничем не подтверждена. Однако несомненно, что регуляция актив­ности генов может осуществляться с помощью двух других вышеупомянутых механизмов, т. е. путем изменения коли­чества транскрибируемой ДНК и общей скорости счи­тывания.

Общая скорость транскрипции, как и всякий синтети­ческий процесс, зависит от энергетического баланса клетки, наличия необходимых предшественников и концентрации участвующих в этом синтезе ферментов. Известно, что из­менения во внешней среде, причем зачастую самые незна­чительные, могут вызывать очень резкие сдвиги в скорости синтеза РНК. Но изучение такой формы регуляции дает нам слишком мало для понимания механизма действия ге­нов. По существу в центре внимания должны быть механиз­мы, от которых зависит специфичность регуляции генов, т. е. механизмы, определяющие, с каких генов будет про­исходить считывание и с каких нет.

Ранее уже обсуждались опыты, проведенные на бакте­риях; результаты этих опытов показали, что присоединение специфичных репрессоров может выключать отдельные гены или небольшие группы генов. Недавно был предложен другой механизм, контролирующий транскрипцию, кото­рый основан на взаимодействии ДНК с РНК-полимера­зой — ферментом, ответственным за транскрипцию. Несом­ненно, должны существовать какие-то механизмы, с по­мощью которых считывание начинается с самого начала гена и прекращается на его конце, иначе большинство молекул матричных РНК оказались бы незавершенными или частично перекрывающимися.

В настоящее время мы располагаем достаточно убеди­тельными данными о том, что на самом деле такого хаоса не наблюдается благодаря наличию в начале каждого гена (или последовательности генов) специфичного участка, который РНК-полимераза может распознавать как точку инициации транскрипции (например, область р для лак­тозных генов Е. coli). Соответственно на другом конце гена (или группы генов) имеются, по-видимому, участки, рас­познаваемые ферментом как точки, в которых синтез дол­жен прекратиться. Некоторое представление о том, каким образом происходит такое распознавание, недавно было получено при изучении РНК-полимеразы Е. coliЭтот фер­мент состоит, по-видимому, из двух частей, одна — так называемый основной фермент (core enzyme) — представ­ляет собой собственно РНК-полимеразу, обладающую, однако, низкой специфичностью к субстрату, тогда как другая — так называемый сигма-фактор, — вероятно, от­ветствен за узнавание точек инициации транскрипции [25]. Например, в отсутствие сигма-фактора РНК-полимераза Е. coli может начинать транскрипцию ДНК бактериофа­га Т4 с любой точки, но если добавить этот фактор, то счи­тываются только те гены, которые обычно проявляются in vivo в первую минуту после начала транскрипции [26].

Когда РНК-полимераза Е. coli транскрибирует ДНК бактериофага fd в отсутствие сигма-фактора, то образую­щиеся нити РНК начинаются с таких нуклеотидов, кото­рых обычно не бывает в начале молекул, синтезированных in vivo; однако после введения сигма-фактора синтез таких аномальных нитей резко уменьшается [27]. Итак, ясно, что сигма-фактор в какой-то степени обеспечивает специфич­ность РНК-полимеразы, но трудно поверить, что системы распознавания, заложенные в структуре РНК-полимеразы, могут быть единственным механизмом, обеспечивающим избирательную транскрипцию отдельных генов или не­больших групп генов. Это потребовало бы не только су­ществования целого набора сигма-факторов, число которых должно было бы соответствовать числу транскрибирую­щихся единиц, но и существования специальных механиз­мов, контролирующих синтез самих сигма-факторов, а также наличия кофакторов, регулирующих присоединение этих сигма-факторов к распознаваемым генам. Таким об­разом, мы просто-напросто приходим к другой версии мо­дели генетического оператора, где в качестве регулирую­щих единиц выступают сигма-факторы РНК-полимераз. Трудности объяснения регуляции синтеза белка на основе механизмов, действующих только на уровне ДНК, не сни­маются, если ввести в модель, помимо репрессоров, еще и сигма-факторы, сложность же такой модели непомерно возрастает.

Имеются ли какие-нибудь доказательства, позволяющие применить модель генетического оператора к клеткам выс­ших организмов? Существуют ли хоть какие-то указания на то, что в этих клетках транскрипция отдельных генов или небольших групп генов может избирательно подав­ляться? Вот список всех известных мне случаев, где име­ются прямые доказательства избирательного подавления синтеза РНК у эукариотов:

1) Инактивация всего отцовского набора хромосом у червеца Pseudococcus obscurus [28].

2) Инактивация одной из половых хромосом у некото­рых видов позвоночных [29—31].

3) Инактивация конденсированных участков хроматина в интерфазных ядрах некоторых дифференцированных соматических клеток животных [32].

4) Инактивация дисков или сегментов гигантских политенных хромосом в клетках желез некоторых насеко­мых [33, 34].

Я не буду обсуждать здесь вопрос о регуляции генети­ческой активности гетерохроматиновых хромосом или гете­рохроматиновых участков, выявляемых в хромосомах на препаратах метафазных пластинок. Сейчас уже ясно, что во многих этих гетерохроматиновых участках находятся гены, активность которых выявляется фенотипически. Но в огромном большинстве случаев мы не знаем, идет ли синтез РНК в гетерохроматиновых участках в течение всей интерфазы, как это, вероятно, происходит в гетерохромати­новых участках, ответственных за образование ядрышек, или РНК синтезируется в определенное строго установлен­ное время, или, наконец, эти участки, как и гетерохромати­новые Х-хромосомы, чрезвычайно мало активны. Таким образом, мне придется ограничить обсуждение четырьмя случаями, где действительно есть прямые доказательства общего или частичного подавления синтеза РНК. Следо­вательно, выводы, которые я могу сделать, основываются на очень небольшом экспериментальном материале (В первом издании этой книги я воздержался от обсуждения результатов, полученных с помощью метода гибридизации ДНК и РНК высших клеток, так как считал, что этот метод еще нельзя применять к высшим клеткам. Дальнейшие исследования подтвер­дили, что я был прав [106—109]. Мне кажется, что результаты, по­лученные с помощью этого метода, все еще недостаточно надежны. [Представляется неправомерным полное отрицание данных, полу­ченных методом гибридизации нуклеиновых кислот, имеющим (по крайней мере, в некоторых случаях) очень высокую разрешающую способность: так, с помощью этого метода в геноме клетки позво­ночного удается выявить интегрированные геномы онкогенных вирусов, составляющие около одной миллионной всей ДНК клетки (Westphal Н., Dulbecco R., Proc. natn. Acad. Sei. USA, 59, № 4, 1158, 1968). В трансформированных вирусами клетках можно опреде­лять, какие именно гены вируса (ранние или поздние) считываются, и таким образом исследовать активность очень небольшого чис­ла генов (Fujinaga К., Green H., Proc. natn. Acad. Sei. USA, 65, 1, 375, 1970; Martin M. A., Axelrod D., Proc. natn. Acad. Sei. USA, 64, 4, 1203, 1969). — Прим. ред.]).

Инактивация отцовского набора хромосом у червеца, так же как и инактивация одной из Х-хромосом у некото­рых позвоночных, — это, мне кажется, частный случай более широко распространенного явления — полной эли­минации некоторых или всех хромосом одного из родитель­ских наборов. Например, у самцов грибного комарика Sciara элиминируются все отцовские хромосомы и функ­ционирует лишь один материнский набор [35]. У других родственных видов самцы развиваются из неоплодотворен­ных яиц и содержат поэтому только материнские хромосо­мы [36]. Вполне вероятно, что инактивация отцовского на­бора у червеца — это просто другой способ достижения той же цели, и возможно, что инактивация возникла в эволю­ции как альтернатива элиминации. Этот вывод, очевидно, применим и к инактивации одной из Х-хромосом у самок некоторых позвоночных. У некоторых видов насекомых одна из половых хромосом обычно элиминируется на ран­них стадиях развития [37]; то же самое наблюдается у не­которых высших млекопитающих [38] и сумчатых [39, 40], у которых самки имеют всего одну Х-хромосому. И здесь инактивация (но сохранение) одной из Х-хромосом в эво­люционном аспекте, вероятно, равнозначна полному ее удалению.

Эти два случая избирательного подавления синтеза РНК не имеют, я думаю, ничего общего с теми явлениями цитоплазматической регуляции, которые я обсуждал в предыдущих главах. Инактивация этих хромосом, как пра­вило, постоянная и фактически полная; за редкими исклю­чениями, она происходит во всех тканях организма и за­трагивает только одну из двух гомологичных хромосом или один из хромосомных наборов. Эта форма инактивации хромосом играет, по-видимому, большую роль в эволюции и онтогенезе, но трудно представить себе, каким образом с помощью инактивации может контролироваться скорость синтеза отдельных цитоплазматических белков.

Несмотря на то, что прямые измерения были проведены только для очень небольшого числа типов клеток, вполне вероятно, что и в других конденсированных гетерохрома­тиновых или гетеропикнотических участках интерфазных ядер синтезируется гораздо меньше РНК, чем в эухромати­не. В некоторых высокодифференцированных клетках в процессе дифференцировки значительно уменьшается объ­ем ядра, что сопровождается уплотнением большей части хроматина. В таких участках конденсированного хромати­на синтез РНК подавляется, а иногда синтез РНК может полностью прекратиться во всем ядре. Этот процесс наи­более четко проявляется в дифференцирующихся эритро­цитах некоторых позвоночных, где постепенная конденса­ция хроматина сопровождается уменьшением синтеза РНК, по мере того, как клетка приобретает специальные морфологические признаки [41].

Такой тип ядерной дифференцировки — это, по-види­мому, один из способов погружения клетки в своего рода «спячку», когда клетка утрачивает многие виды активнос­ти и даже способность к размножению. В тех случаях, когда такое состояние обратимо (например, у малых лим­фоцитов или фибробластов позвоночных), при возобновле­нии высокой метаболической активности ядро вновь увели­чивается и конденсированный хроматин диспергируется. И здесь инактивация ядра, если рассматривать этот про­цесс в эволюционном аспекте, очевидно, соответствует его элиминации: у млекопитающих в ходе дифференцировки ядро эритроцита элиминируется полностью [42], тогда как у амфибий, рептилий, птиц и некоторых других классов животных ядра в эритроцитах сохраняются, но, по-видимо­му, полностью инактивируются.

В ядрах активных клеток могут иногда содержаться небольшие участки конденсированного хроматина (хромоцентры) в дополнение к тому, который образуется при конденсации одной из Х-хромосом [43, 44]. Быть может, такой хроматин и представляет собой гетерохроматиновые участки, выявляемые в метафазных хромосомах, но пока это не доказано. Не удивительно, если окажется, что в хро­моцентрах синтезируется очень мало РНК или она не син­тезируется вовсе. Однако, насколько мне известно, такие опыты еще не проведены. Хромоцентры могут сохраняться в течение всей жизни клетки или же возникать только на определенных стадиях клеточного цикла; кроме того, они содержатся не во всех клетках одной и той же ткани или органа. Для образования даже самых мелких хромоцентров должно инактивироваться огромное число генов. Пока у нас еще нет точных данных о том, к каким фенотипическим последствиям приводит такая частичная инактивация больших участков генетического материала. Суть вопроса заключается в том, является ли подавление синтеза РНК, вызываемое этим механизмом, одним из способов достиже­ния клетками дифференцированного состояния, или же это подавление активности генов само является следствием специализации. В следующей главе я приведу доводы в пользу второго предположения. Здесь же достаточно ска­зать, что эта форма генетической инактивации, хотя и воз­можна для отдельных участков хроматина, значительно меньших, чем целая хромосома, все же еще не достаточно тонка, чтобы служить основой механизма регуляции синте­за специфических белков в цитоплазме.

  1. Пуффы в политенных хромосомах

Мы подошли теперь к тому единственному случаю, ко­торый, по крайней мере на первый взгляд, как будто бы служит морфологическим подтверждением модели генети­ческого оператора регуляции синтеза белка, — речь пойдет о гигантских политенных хромосомах некоторых насе­комых. Такие хромосомы обнаружены у личинок многих видов двукрылых в клетках некоторых тканей, особенно в производных кишечника. Наиболее тщательно изучены слюнные железы, хромосомы которых необычны в двух отношениях. Во-первых, они высокополитенны. Каждая хромосома содержит тысячи копий исходной диплоидной генетической структуры. Степень политении может варьи­ровать у разных видов. Например, оказалось, что у Chiro­nomus tentans каждая хромосома содержит в 16 000 раз больше ДНК, чем хромосомы нормальных диплоидных клеток [45]. Этим объясняется гигантский размер политен­ных хромосом, а также то, что в них можно обнаружить такие морфологические особенности (резко увеличенные благодаря политении), какие не выявляются в обычном диплоидном наборе. По-видимому, далеко не все гены ис­ходного диплоидного набора реплицируются в одинаковой степени; очевидно, в процессе политенизации не участвуют гетерохроматиновые области, и поэтому в гигантских хро­мосомах они представлены минимально [46]. Второе не­обычное свойство политенных хромосом состоит в том, что в течение большей части жизненного цикла клетки они сохраняют вид дискретных уплотненных образований. По­этому физиологическое состояние гигантских хромосом напоминает затянувшуюся и, поскольку клетка не делится, абортивную профазу. Трудно сказать, насколько резуль­таты изучения физиологии этих необычных хромосом мож­но экстраполировать на нормальные, диплоидные клетки. Но если экстраполяция возможна, то есть основания про­водить параллель между этими клетками и обычными диплоидными клетками в той стадии профазы митоза, ког­да хромосомы уже сконденсированы в дискретные едини­цы, но тем не менее синтезируют некоторое количество РНК.

Большая часть генетического материала гигантских хромосом неактивна. Во всем хромосомном наборе у Drosophila имеется примерно 2000 дисков, а у Chironomusпо-видимому, примерно 5000 дисков, но всего лишь прибли­зительно в 300 из них удалось наблюдать синтез РНК или образование «пуффов» — характерных изменений морфо­логии дисков, возникающих при их активации [33] (фото III, А). Максимальное число дисков, активных од­новременно, и того меньше: никогда не наблюдали, чтобы синтез РНК в какой-то момент происходил более чем в 200 дисках. Определение содержания ДНК в отдельных дисках показало, что диск средних размеров возникает при политенизации первичной единицы, содержащей такое ко­личество ДНК, которого достаточно примерно для 100 ге­нов [45], а во многих дисках находится значительно больше ДНК. Таким образом, даже в этих хромосомах мы имеем дело с активацией и инактивацией сравнительно крупных единиц генетического материала. Активация их происходит в результате политении. Синтез РНК в каждом отдельном диске зависит от возникновения пуффа, в котором откры­ваются и становятся доступными для считывания много­численные политенные копии основной генетической еди­ницы (фото III, Б). Активность каждой генетической еди­ницы определяется числом политенных копий, доступных для считывания.

Политенные хромосомы

Политенные хромосомы

Трудно себе представить, как такой регуляторный меха­низм, целиком зависящий от степени политении хромосо­мы, может функционировать в неполитенных хромосомах. Если в нормальных диплоидных клетках цепи двойной спирали ДНК расходятся в процессе транскрипции, то про­цесс транскрипции можно уподобить образованию пуффов; но у нас нет доказательств, что обе цепи ДНК действи­тельно расходятся во время транскрипции, и уж во всяком случае в отличие от образования пуффов такой процесс не может обеспечить регуляцию синтеза РНК в отдельных локусах.

Считалось, что характер распределения пуффов специ­фичен для каждого органа [47], однако имеющиеся доказа­тельства кажутся недостаточно убедительными. Более того, выяснилось, что характер распределения пуффов в хромо­сомах может быть различен не только в разных тканях, но и в клетках одной и той же ткани у одной и той же особи и что он зависит от физиологического состояния животно­го или от стадии развития личинки. Когда приняли во вни­мание физиологически обусловленные изменения в распо­ложении пуффов, то оказалось, что тканеспецифичных пуффов, т. е. таких, которые имеются в клетках только одной ткани, очень мало, а возможно, их и вообще нет [48]. В некоторых локусах пуффы обнаруживаются на многих стадиях развития личинки, тогда как в других они возни­кают только на определенных стадиях [33, 34, 48]. В слюн­ных железах наибольшее количество пуффов наблюдается непосредственно перед линькой, особенно перед выходом мухи из кокона, когда происходит метаморфоз и слюнные железы рассасываются. Распределение пуффов, характер­ное для этой стадии, сохраняется даже тогда, когда начи­нается аутолиз клеток слюнных желез.

Фенотипические проявления таких различий в распре­делении пуффов еще далеко не ясны, но кажется мало­вероятным, что образование пуффов может немедленно определять синтез каких-либо цитоплазматических белков. Участок хромосомы, в котором образуется пуфф, слишком велик не только для того, чтобы контролировать синтез од­ного-единственного белка, но и для того, чтобы координиро­ванно регулировать синтез функционально связанной груп­пы ферментов; исключение составляют двукрылые, у ко­торых размер таких групп на порядок или более превышает размер групп у бактерий. Как я уже отмечал, только 200— 300 дисков образуют пуффы, причем во многих из них пуффы сохраняются более или менее постоянно. Имеются данные, что в слюнных железах некоторые пуффы опреде­ляют синтез секреторных белков [49—52], хотя, вероятно, многие белки, выделяемые слюнными железами, не синте­зируются в них, а только поглощаются клетками из гемо­лимфы [53]. Некоторые пуффы из гигантских клеток, находящихся в лапках мухи, по-видимому, определяют синтез и созревание кутикулы [34].

Высокая активность пуффов в период линьки позволяет предположить, что в некоторых из них синтезируется мат­ричная РНК для ферментов, находящихся в составе лизосом, которые разрушают железу в процессе метаморфоза [54, 55]; возможно также, что пуффы участвуют в образо­вании веществ, необходимых уже после метаморфоза. В самом деле, почему бы некоторым РНК, синтезирован­ным на пуффах, не нести информацию для специфичных белков; но едва ли можно согласиться с предположением, будто бы появление и исчезновение пуффов определяют начало и конец синтеза какого-то конкретного белка (как это следует из модели генетического оператора). Даже когда в слюнных железах Chironomus tentans синтез РНК ингибировали в течение 48 ч с помощью актиномицина D, образование белков слюнных желез продолжалось с обыч­ной скоростью, а в клетках Chironomus pollidivittatus по-прежнему синтезировался материал специфичных гранул, связанных с секрецией слюны [56, 57]. Образование альбу­мина в слюнных железах также нечувствительно к инги­бированию синтеза РНК актиномицином [58]. Таким обра­зом, картина регуляции синтеза белка в клетках этих желез, несмотря на образование в них пуффов, соответству­ет в основном той общей картине, которую мы уже наблю­дали при исследовании ацетабулярии и других высших клеток.

  1. Механизмы, управляющие транскрипцией

Теперь нам необходимо рассмотреть механизмы, с по­мощью которых происходит подавление синтеза РНК в хромосомах клеток эукариотов. Модель генетического опе­ратора постулирует очень высокую точность регуляторных механизмов, действующих на уровне генов: они должны «включать» или «выключать» единичные гены или неболь­шие группы генов. При таком типе регуляции сигналы, приходящие к генам из цитоплазмы, должны обладать соответствующей степенью специфичности, т. е. отличать один ген от другого. Жакоб и Моно предполагали, что в цитоплазме имеется большой набор специфичных молекул (репрессоров), которые могут узнавать соответствующие гены и, присоединяясь к этим генам, ингибировать их транскрипцию.

При координированной регуляции группы тесно сцеп­ленных генов молекула репрессора подавляет транскрип­цию всей этой группы генов. Но всегда, когда мы встреча­емся со случаями локализованного подавления транскрип­ции больших участков генома у высших организмов, механизм этого подавления, по-видимому, обусловлен дру­гими причинами. Например, когда происходит инактивация гаплоидного набора хромосом или одной из половых хро­мосом, очевидно, что цитоплазматические сигналы (если они в этом участвуют) не способны отличить один локус от другого и должны действовать на совершенно ином уровне. В первом случае им необходимо просто отличать весь отцовский хромосомный набор от всего материнского, причем инактивация отцовского набора не может опреде­ляться кумулятивным действием широкого круга специ­фичных генных репрессоров, так как основная часть гене­тического материала в отцовском и материнском наборах одинакова.

При инактивации половой хромосомы предполагаемые цитоплазматические сигналы даже не отличают отцов­скую Х-хромосому от материнской. За исключением нескольких особых случаев [59, 60], инактивация материн­ской или отцовской Х-хромосомы не подчиняется какой-либо закономерности; когда же этих хромосом больше двух, инактивируются все Х-хромосомы, кроме одной [31]. Конт­ролирующий механизм, очевидно, действует таким обра­зом, чтобы обеспечить сохранение только одной активной Х-хромосомы, а не выбирает тот или другой ген.

И в самом деле, транслокации, локализованные в Х-хро­мосоме, с очевидностью доказывают, что при инактивации хромосомы отдельные гены не распознаются. Когда фраг­мент обычно инактивированной Х-хромосомы переносят в активную область аутосомы, этот фрагмент не инактивируется [61, 62]; когда же в неактивную Х-хромосому пере­носят фрагмент обычно активной аутосомы, то этот фраг­мент инактивируется [63, 64]. Ясно, что для механизма инактивации важно не то, какие это гены, а то, где они находятся.

У позвоночных в процессе окончательной дифферен­цировки определенных типов специализированных клеток происходит конденсация и, вероятно, инактивация боль­ших участков хроматина, что скорее всего связано с по­степенным уменьшением размеров ядра. Появление в клетках, не достигших окончательной дифференцировки, небольших хромоцентров, очевидно, также связано с из­менением объема ядра [41, 65, 66]. И в этих случаях, вероятнее всего, имеются какие-то цитоплазматические сигналы, которые способны инактивировать очень большие участки хроматина, но не отдельные гены или группы тесно сцепленных генов.

Некоторые сведения о природе механизмов, обеспечи­вающих избирательную конденсацию отдельных участков хроматина, недавно получили Крегер и др. [67, 68]. Эти исследователи показали, что расположение пуффов в поли­тенных хромосомах двукрылых не зависит от потока специфичных сигналов, приходящих из цитоплазмы. Если с помощью микрургических процедур удалить из клетки фактически всю цитоплазму, то оставшиеся в ядре хромо­сомы сохранят способность образовывать пуффы, лока­лизованные в соответствующих местах [67, 69]. Замещение большей части цитоплазмы в клетке одного типа цитоплаз­мой клетки другого типа, обладающей иным характером распределения пуффов, также не сказывается на картине распределения пуффов в клетке-реципиенте [70, 71]. Когда микрургическим путем удаляют большую часть хромосомы, распределение пуффов в оставшемся фрагменте почти не изменяется. Эти опыты показывают, что расположение пуффов не зависит не только от специфичных репрессоров, поступающих из цитоплазмы, но также и от каких-либо иных сигналов, передающихся из одной части ядра в другую.

По-видимому, на политенные хромосомы оказывает влияние движение воды и электролитов через ядерную мембрану, и характер расположения пуффов, по крайней мере отчасти, определяется неодинаковой чувствитель­ностью разных участков хромосомы к изменениям осмоти­ческого давления и концентрации некоторых катионов [72-74].

Более того, Левенштейн и Канно [75, 76] показали, что ядерная мембрана клеток слюнных желез, хотя и содержит «поры», но тем не менее представляет собой барьер, пре­пятствующий свободному передвижению ионов. Отсюда можно сделать вывод, поддерживающий представление о том, что картина распределения пуффов в политенных хро­мосомах есть результат взаимодействия этих хромосом с ионами, определяющими конденсированно или диспер­гированное состояние хроматина в каждом конкретном локусе. С этой точки зрения специфичность распределения пуффов зависит не от специфичности сигналов, поступаю­щих в хромосому, а от особенностей структуры самой хро­мосомы, разные локусы которой по-разному реагируют на изменения концентрации электролитов в окружающей среде.

Хотя до сих пор прямой экспериментальный подход к этой проблеме в силу чисто технических причин ограничен исследованиями крупных клеток двукрылых, Зиберту и др. [77, 78] недавно удалось показать, что концентрация элек­тролитов в ядрах соматических клеток позвоночных очень сильно отличается от концентрации их в цитоплазме. А Рингерц и Боланд [79] обнаружили, что первоначальные цитохимические изменения хроматина в ядре эритроцита, возникающие при возобновлении его активности в гетеро­карионе (см. гл V), можно воспроизвести в изолированных ядрах эритроцитов, если удалить из среды двухвалентные катионы.

Поэтому мне кажется вполне вероятным, что из­бирательная конденсация хроматина, наблюдающаяся в интерфазных ядрах большинства клеток, может оказаться следствием неодинаковой чувствительности разных участ­ков хроматина к изменениям концентрации электролитов во внешней среде.

Все это мало напоминает схемы, основанные на высо­кой специфичности узнавания, которые предусматривают­ся моделью генетического оператора, и в сущности свиде­тельствует против широкого применения таких схем по отношению к клеткам высших организмов. Ведь если ос­новная масса генетического материала репрессируется механизмами, обладающими слабой специфичностью, то сфера действия высокоспецифичных механизмов должна быть очень ограниченной. Рассматривая любую возможную аналогию между формами генетической регуляции, кото­рые могут наблюдаться в клетках высших организмов, и любыми сходными процессами, имеющимися у бактерий, следует принять во внимание один важный факт. Если избирательная конденсация хроматина в высших клетках действительно зависит от изменения концентраций элек­тролитов в ядре, то трудно понять, каким образом подоб­ный тип регуляции может осуществляться у бактерий, у ко­торых в отличие от высших форм нет ядерной мембраны и ДНК не связана со структурным белком. Поэтому, мне кажется, нет достаточных оснований считать, что у бакте­рий имеется какой-то механизм регуляции, подобный тому, который я только что рассмотрел, говоря о высших клетках.

  1. Контроль передачи информации из ядра

Помимо регуляции транскрипции и трансляции, у выс­ших клеток существуют три других способа регуляции, которые, по-видимому, влияют на проявление генетической информации. Это, во-первых, механизмы, регулирующие отделение матриц от ДНК, во-вторых, механизмы, контро­лирующие переход этих матриц через ядерную мембрану, и, в-третьих, механизмы, отбирающие для передачи в цито­плазму только какую-то часть матриц, синтезированных на ДНК. На основании результатов опытов, проведенных на бактериях, было сделано предположение, что процессы трансляции и транскрипции тесно связаны друг с другом, причем связь эта не ограничивается автоматическим пре­кращением трансляции с прекращением синтеза самой матрицы [5].

На электронных микрофотографиях препаратов разру­шенных бактерий видно, что во время транскрипции к ДНК присоединяются рибосомы [80]; опыты с меткой подтвердили, что в таких препаратах РНК, синтезирован­ная на этой ДНК, действительно переносится на рибосомы [81]. Это наблюдение обычно считают подтверждением гипотезы об участии рибосом в отделении матриц от ДНК у бактерий. Что касается клеток высших организмов, то по отношению к ним такое предположение вряд ли прием­лемо. В ядрах высших клеток очень мало сформировавших­ся рибосом, возможно, их нет совсем [82—85]; те же струк­туры, которые на основании морфологических критериев можно принять за какие-то виды рибосом, локализованы, по-видимому, исключительно в области ядрышка [86]. О том, что в непосредственной близости от основной массы хроматина располагается сколько-нибудь заметное коли­чество сформировавшихся рибосом, также нет никаких сведений. И если нам не приходится сомневаться, что ско­рость отделения РНК от хромосом зависит от многих фак­торов, то, насколько мне известно, мы не располагаем ка­кими-либо данными, которые подтверждали бы существо­вание некоего механизма, производящего это отделение избирательно.

В любом локусе, в котором ингибировано отделение РНК, ингибирована тем самым и дальнейшая транскрипция, поэтому любая модель, постулирующая высокоизби­рательное отделение матриц, постулирует также высоко­избирательное подавление транскрипции. Таким образом, все, что я говорил о специфичности механизмов, регулиру­ющих транскрипцию в высших клетках, в равной степени можно отнести к любым механизмам, регулирующим отде­ление матриц. Возможно, что скорость освобождения РНК в разных частях ядра не одинакова. Но вряд ли прекраще­ние отделения матриц может быть основным механизмом, регулирующим проявление генов. Если бы это было так, то к неактивным генам, так же как и к активным, была бы присоединена РНК. Однако соотношение ДНК: РНК в яд­рах клеток высших организмов показывает, что на самом деле большая часть ДНК не связана с РНК [87].

В настоящее время представляется совершенно очевид­ным, что через ядерную мембрану (по крайней мере, в не­которых соматических клетках) не могут свободно про­ходить даже электролиты, поэтому трудно себе предста­вить, что она проницаема для молекул растворенной РНК. Следовательно, есть все основания предполагать наличие специальных механизмов, осуществляющих передачу РНК через мембрану. За возможным исключением семейств РНК с коэффициентом седиментации, таким же, как у транспортных РНК, в цитоплазме не содержится никаких других свободных РНК. Итак, перенос РНК через ядерную мембрану можно рассматривать как сложный процесс, включающий перенос РНК, ранее объединившейся с бел­ком или объединяющейся с ним специально для переноса через мембрану ядра.

Я уже указывал, что, с моей точки зрения, лимитирую­щей стадией передачи информации из ядра в цитоплазму служит не синтез матриц, а включение матриц в структу­ры, защищающие их от разрушения внутри ядра. Кроме того, я высказал предположение, что быстрый внутриядер­ный обмен РНК, происходящий, по-видимому, во всех клетках, но с разной скоростью [45, 88—96], есть не что иное, как элиминация внутри ядра всех тех матриц, кото­рые не включились в эти структуры и оказались, таким образом, свободными. В следующей главе я представлю более конкретную модель механизма передачи информации и приведу некоторые доводы в ее пользу.

  1. Разрушение ферментов как способ регуляции

Поскольку у бактерий в период экспоненциального роста деградация белков очень незначительна [97—99], существует возможность, на которую до последего времени почти не обращали внимания, а именно что количество ферментов в клетке может зависеть от скорости их разру­шения. Но у бактерий в стационарной фазе роста и в клет­ках высших животных, которые растут экспоненциально только в исключительных условиях, обмен белков проис­ходит достаточно интенсивно [100—103]. Недавно были по­лучены убедительные доказательства, свидетельствующие о том, что концентрация ферментов в животных клетках может определяться не только скоростью их синтеза, но и скоростью их распада. Наиболее подробные исследования по этому вопросу провели Шимке и др. [104, 105]; они из­учали содержание аргиназы и триптофанпирролазы в клетках печени. Эти ферменты подвергаются заметному обмену, и количество их в клетке растет при добавлении соответствующего субстрата — аргинина или триптофана. Шимке с сотрудниками показали, что накопление фермента в присутствии субстрата в значительной степени обусловле­но уменьшением скорости распада фермента, так как суб­страт стабилизирует его молекулы. Вероятно, в дальней­шем будет доказано, что стабилизация фермента под дей­ствием субстрата — явление огромной важности, которое обеспечивает регуляцию содержания ферментов в высших клетках. Взаимодействие такого рода представляет собой дополнительный регуляторный механизм не только в выс­шей степени специфичный, но и очень гибкий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Watson J. D.,Molecular biology of the gene, p. 332, Benjamin, New York. (УотсонМолекулярная биология гена, изд-во «Мир», М., 1967.)
  2. SiekevitzР., Palade G. E., Distribution of newly synthesized amylase in microsomal subfractions of guinea pig pancreas, J. Cell Biol., 30, 519 (1966).
  3. Barondes S. H., Nirenberg M. W.,Fate of a synthetic polynucle­otide directing cell-free protein synthesis. I. Characteristics of degradation, Science, N. Y., 138, 810 (1962).
  4. AmesВ. N., Hartman P. E., The histidine operon, Gold Spring Harb. Symp. quant. Biol., 28, 349 (1963).
  5. Stent G. S.,The operon: on its third anniversary, Science, N. Y., 144, 816 (1964).
  6. Schlesinger S., MagasanikВ., Effect of a-methylhistidine on the control of histidine synthesis, J. molec. Biol., 9, 670 (1964).
  7. Roth J. R., Anton D. N.,Hartman P. E., Histidine regulatory mutants in Salmonella typhimurium. I. Isolation and general properties, J. molec. Biol., 22, 305 (1966).
  8. Roth J. R.,Ames B. N., Histidine regulatory mutants in Sal­monella typhimurium. II Histidine regulatory mutants having altered histidyl-tRNA synthetase, J. molec. Biol., 22, 325 (1966).
  9. Silbert D.F., Fink G. R., Ames B. N., Histidine regulatory mutants in Salmonella typhimurium. III. A class of regulatory mutants deficient in tRNA for histidine, J. molec. Biol., 22, 335 (1966).
  10. Eidlic L., NeidhardtF. C, Role of valyl-sRNA synthetase in enzyme repression, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 53, 539 (1965).
  11. Ravel J. M., White M. N., Shive W.,Activation of tyrosine analogs in relation to enzyme repression, Biochem. biophys. Res. Commun., 20, 352 (1965).
  12. NeidhardtF. C, Roles of amino acid activating enzymes in cellular physiology, Bact. Rev., 30, 701 (1966).
  13. HirshfieldI. N., DeDeken R., Horn P. C, Hop wood D. A., Maas W. K., Studies on the mechanism of repression of arginine biosynthesis in Escherichia coli, J. molec. Biol., 35, 83 (1968).
  14. LeisingerТ., Vogel H. J., Repression by arginine in Escheri­chia coli: a comparison of arginyl transfer RNA profiles, Biochim. biophys. Acta, 182, 572 (1969).
  15. VogelH. J., Repression and induction as control mechanisms of enzyme biogenesis: the “adaptive” formation of acetylorni-thinase. The chemical basis of heredity (Eds. W. D. McElroy and B. Glass), p. 276, Johns Hopkins Press, Baltimore, USA, 1957. (Химические основы наследственности, ИЛ, М.,1960, стр. 218).
  16. GruberМ., Campagne R. N., Regulation of protein synthesis: an alternative to the repressor-operator hypothesis, Proc. K. ned. Akad. Wet. Series C, 68, I (1965).
  17. Cline A. L., Bock R. M.,Translational control of gene expres­sion, Cold Spring Harb. Symp. quant. Biol., 31, 321 (1966).
  18. SomervilleR. L., Yanofsky C., Studies on the regulation of tryp­tophan biosynthesis in Escherichia coli, J. molec. Biol., 11, 747 (1965).
  19. 19.,Kovach J. S-,Berberich M. , Venetianer P., Goldber-

ger R. F., Repression of the histidine operon: effect of the first enzyme on the kinetics of repression, J. Bact., 97, 1283 (1969).

  1. BerberichM., Gots J., A structural gene mutation in Salmonel­la typhimurium resulting in repressibility of adenylosuccinase, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 54, 1254 (1965).
  2. Hill C. W., Echols H.,Properties of a mutant blocked in inducibility of mRNA for the galactose operon of E. coli, J. mo-lee. Biol., 19, 38 (1966).
  3. PardeeАВ., Prestidge L. S., The initali kinetics of enzyme induction, Biochim. biophys. Acta, 49, 77 (1961).
  4. VogelR. H., Vogel H. J., Onset of repression and derepres-sion in arginine path of Bacillus subtilis: a delayed-action «switch», Biochem. biophys. Res. Commun., 18, 768 (1965).
  5. Pollock M. P.,Penicillinase adaptation in Bacillus cereus: an analysis of three phases in the response of logarithmically growing cultures to induction of penicillinase formation by pe­nicillin, Br. J. exp. Path., 33, 587 (1952).
  6. Burgess R. R., Travers A. A., Dunn J. J., Bautz E. K.F., Factor stimulating transcription by RNA polymerase, Nature, Lond., 221, 43(1969).
  7. Bautz E. K.F., Bautz F. A., Dunn J. J., E. coli a-factor: a positive control element in phage T4 development, Nature, Lond., 223, 1022 (1969).
  8. Sugiura M., OkamotoТ., Takanami M., RNA polymerase a-factor and the selection of initiation site, Nature, Lond., 225, 598 (1970).
  9. Berlowitz L.,Correlation of genetic activity, heterochromatiza-tion and RNA metabolism, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 53, 68 (1965).
  10. Evans H. J., Ford C. E.,Lyon M. F., Gray J., DNA repli­cation and genetic expression in female mice with morphologically distinguishable X chromosomes, Nature, Lond., 206, 900 (1965).
  11. Comings D. E.,Uridine-5-3H radioautography of the human sex chromatin body, J. Cell Biol., 28, 437 (1966).
  12. Hamerton J. L.,Significance of sex chromosome derived hetero­chromatin in mammals, Nature, Lond., 219, 910 (1968).
  13. Littau V. C,Allfrey V. G., Frenster J. H., Mirsky A. E., Active and inactive regions of nuclear chromatin as revealed by electron microscope autoradiography, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 52, 93 (1964).
  14. Pelling C.,Ribonukleinsäure-Synthese der Riesenchromosomen, Chromosoma, 15, 71 (1964).
  15. Whitten J. M.,Coordinated development in the foot pad of the fly Sarcophaga bullata during metamorphosis: changing puffing patterns of the giant cell chromosomes, Chromosoma, 26, 215 (1969).
  16. Crouse H. V.,Translocations in Sciara. Their bearing on chro­mosome behavior and sex determination, Univ. Missouri agric. expl Stn Res. Bull. No. 379, p. I (1943).
  17. Brown S. W.,Automatic frequency response in the evolution of male haploidy and other coccid chromosome systems, Genetics, Princeton, 49, 797 (1964).
  18. SwansonС P., Cytology and cytogenetics, pp. 331—335, Mac­millan, London, 1958.
  19. Ohno S., Jainchill J., Stenius C,The creeping vole (Micro­tus oregoni) as a gonosomic mosaic. I. The OY/XY constitution of the male, Cytogenetics, 2, 232 (1963).
  20. Hayman D. L., Martin P. G.,Sex chromosome mosaicism in the marsupial genera isoodon and perameles, Genetics, Prince­ton, 52, 1201 (1965).
  21. Hayman D. L., Martin P. G., Waller P.F., Parallel mosai­cism of supernumerary chromosomes and sex chromosomes in Echymipera kalabu (Marsupialia), Chromosome, 27, 371 (1969).
  22. Cameron I. L.,Prescott D. M., RNA and protein metabolism in the maturation of the nucleated chicken erythrocyte, Expl. Cell. Res., 30, 609 (1963).
  23. Skutelsky E., Danon D.,An electron microscopic study of nuclear elimination from the late erythroblast, J. Cell Biol., 33, 625 (1967).
  24. Mittwoch U.,Barr bodies in relation to DNA values and nuc­lear size in cultured human cells, Cytogenetics, 6, 38 (1967).
  25. Abercrombie M., Stephenson E. M.,Observations on chromo-centres in cultured mouse cells, Nature, Lond., 222, 1250 (1969).
  26. Edström J.E., Chromosomal RNA and other nuclear RNA frac­tions. Role of the chromosomes in development (Ed. M. Locke), p. 137, Academic Press, New York, 1965.
  27. Rudkin G.Т., Nonreplicating DNA in giant chromosomes, Ge­netics, Princeton, 52, 470 (1965).
  28. Beermann W.,Chromomerenkonstanz und spezifische Modifika­tionen der Chromosomenstruktur in der Entwicklung und Organ­differenzierung von Chironomus tentans, Chromosoma, 5, 139 (1952).
  29. Clever U.,Gene activity patterns and cellular differentiation, Am. Zoologist, 6, 33 (1966).
  30. Beermann W.,Ein Balbiani-Ring als Locus einer Speichel-drüsen-mutation, Chromosoma, 12, 1 (1961).
  31. Panitz R.,Funktionelle Veränderungen an Reisenchromosomen nach Behandlung mit Giberellinen, Biol. Zbl. 86, Suppl., p. 147 (1967).
  32. Baudisch W., Panitz R.,Kontrolle eines biochemischen Merk­mals in den Speicheldrüsen von Acricotopus lucidus durch einen Balbiani-Ring, Expl. Cell. Res., 49, 470 (1968).
  33. GrossbachU.Cell differentiation in the salivary glands of Camptochironomus tentans and C. pallidivittatus, Annls zool. Fenn., 5, 37 (1968).
  34. Doyle D., Laufer H.,Sources of larval salivary gland secretion in the dipteran Chironomus tentans, J. Cell Biol., 40, 61 (1969).
  35. LauferH., Nakase Y., Developmental studies of the dipteran salivary gland. II. DNAase activity in Chironomus thummi, J. Cell Biol., 25, 97 (1965).
  36. Schin K. S., Clever U.,Lysosomal and free acid phosphatase in salivary glands of developing Chironomus tentans larvae, Scien­ce, N. Y., 150, 1053 (1965).
  37. Clever U., Storbeck L., Romball C. G.,Chromosome activity and cell function in polytenic cells. I. Protein synthesis at va­rious stages of larval development, Expl Coll Res., 55, 306 (1969).
  38. Clever U.,Chromosome activity and cell function in polytenic cells. II. The formation of secretion in the salivary glands of Chironomus, Expt Cell Res., 55, 317 (1969).
  39. Doyle D., LauferH., Requirements of ribonucleic acid synt­hesis for the formation of salivary gland specific proteins in larval Chironomus tentans, Expl. Cell. Res., 57, 205 (1969).
  40. Gustavsson J., Fracca.ro M., Tiepolo L.,Lindsten J., Presump­tive X-autosome translocation in a cow: preferential inactivation of the normal X chromosome, Nature, Lond., 218, 183 (1968).
  41. Hamerton J. L., GiannelliF., Collins F., HallettJ., Fryer A., McGuire V. M., Short R. V., Non-random X-inacti­vation in the female mule, Nature, Lond., 222, 1277 (1969).
  42. LyonM. F., Searle A. G., Ford С. E., OhnoS., A mouse translocation suppressing sex-linked variegation, Cytogenetics, 3, 306 (1964).
  43. OhnoS., Lyon M. F., Cytological study of Searle’s X-autosome translocation in Mus musculus, Chromosoma, 16, 90 (1965).
  44. Ohno S., CattanachВМ., Cytological study of an X-autosome translocation in Mus musculus, Cytologenetics. I, 129 (1962).
  45. Cattanach B. M., Isaacson J. H.,Controlling elements in the mouse X-chromosome, Genetics, Princeton, 57, 331 (1967).
  46. MittwochU., Lele К. P., Webster W. S., Relationship of Barr bodies, nuclear size and deoxyribonucleic acid value in cul­tured human cells, Nature, Lond., 205, 477 (1965).
  47. Mittwoch U.,Nuclear sizes in a human diploid/triploid cell culture, Nature, Lond., 219, 1074 (1968).
  48. Kroeger H.,Hormones, ion balances and gene activity in dip-teran chromosomes, Endocrine genetics, Proc. Symp., Cambridge 1966 (Ed. S. G. Spickett), Mem. Soc. Endocr., 15, 55 (1967).
  49. Kroeger H., Lezzi M.,Regulation of gene action in insect de­velopment, A. Rev. Ent., II, I (1966).
  50. Lezzi M.,Induction eines Ecdyson-aktivierbaren Puff in iso­lierten Zellkernen von Chironomus durch KC1, Expl. Cell. Res., 43, 571 (1966).
  51. Kroeger H.,Experiments on the extranuclear control of gene activity in dipteran polytene chromosomes, J. cell. сотр. Physiol. 62, Suppl. I, 45 (1963).
  52. Kroeger H.,Zellphysiologische Mechanismen bei der Regulation von Genaktivitäten in den Riesenchiomosomen von Chironomus thummi, Chromosoma, 15, 36 (1964).
  53. Kroeger H.,Potentialdifferenz und Puff-muster. Elektrophysio-logische und cytologische Untersuchungen an den Speicheldrü­sen von Chironomus thummi, Expl. Cell. Res., 41, 64 (1966).
  54. Lezzi M., Kroeger H.,Aufnahme von 22Na in die Zellkerne der Speicheldrüsen von Chironomus thummi, Z. Naturf., 21b, 274— (1966).
  55. Lezzi M., Gilbert L.I., Differential effects of Kand Naon specific bands of isolated polytene chromosomes of Chironomus tentans, J. Cell. Sei., 6, 615 (1970).
  56. Loewenstein W. R.,Some electrical properties of the membrane of a cell nucleus, Nature, Lond., 195, 462 (1962).
  57. Loewenstein W. R., Kanno Y.,Some electrical properties of a nuclear membrane examined with a microelectrode, J. gen. Physiol., 46, 1123 (1963).
  58. Siebert G., Langendorj H., Hannover R., Nitz-Litzow D., Pres­sman B. C.,Moore C, Untersuchungen zur Rolle des Natrium­Stoffwechsels im Zellkern der Rattenleber, Hoppe-Seyler’s, Z. physiol. Chem., 343, 101 (1965).
  59. Siebert G.,Gewinnung und Funktion isolierter Zellkerne, Z. klin. Chem., 3, 13 (1966).
  60. RingertzN. R., Bolund L., «Activation» of hen erythrocyte deoxyribonucleoprotein, Expl. Cell Res., 55, 205 (1969).
  61. Bladen H. A., Byrne R., Levin J. G., Ntrenberg M. W.,An electron microscopic study of a DNA-ribosome complex formed in vitro, J. molec. Biol., II, 78 (1965).
  62. Jones O. W.,Dieckmann M., Berg P., Ribosomeinduced dis­sociation of RNA from an RNA polymerase DNA-RNA complex, J. molec. Biol., 31, 177 (1968).
  63. CrawleyJ. C. W., Harris H., The fine structure of isolated HeLa cell nuclei, Expl. Cell Res., 31, 70 (1963).
  64. Holtzman E., Smith I., Penman S.,Electron microscopic stu­dies of detergent-treanted HeLa cell nuclei, J. molec. Biol., 17, 131 (1966).
  65. Rogers M. E.,Ribonucleoprotein particles in the amphibian cocyte nucleus. Possible intermediates in ribosome synthesis, J. Cell. Biol., 36, 421 (1968).
  66. Monneron A., MouU Y.,Etude ultrastructurale de particules ribonucleoproteiques nucleaires isolees a partir du foie de rat, Expl. Cell Res., 51, 531 (1968).
  67. Bernhard W.,Ultrastructural aspects of the normal and patho­logical nucleolus in mammalian cells, Natn. Cancer Inst. Mo­nogr. No. 23, p. 13 (1966).
  68. McLeish J.,Quantitative relationships between deoxyribonuc­leic and ribonucleic acid isolated plant nuclei, Proc. R. Soc, B, 158, 261 (1963).
  69. Harris H.,The short-lived RNA in the cell nucleus and its possible role in evolution, Evolving genes and proteins (Eds. V. Bryson and H. J. Vogel), p. 469, Academic Press, New York, 1965.
  70. Bruns G. P., Fischer S., Lowy B. A.,A study of the synthesis and interrelationships of ribonucleic acids in duck erythrocytes, Biochim. biophys. Acta, 95, 280 (1965).
  71. Attardi G., Parnas H., Hwang M., AttardiВ., Grant-size rapidly labeled nuclear RNA and cytoplasmic messenger RNA in immature chick erythrocytes, J. molec. Biol., 20, 145 (1966).
  72. Houssais J.-F., Attardi G.,High molecular weight nonriboso-mal-type nuclear RNA and cytoplasmic messenger RNA in HeLa cells, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 56, 616 (1966).
  73. Adams D. H.,The relationship between cellular nucleic acid in the developing rat cerebral cortex, Biochem. J., 98, 636 (1966).
  74. Owen M.,Uptake of [3H] uridine into precursor pools and RNA in osteogenic cells, J. Cell Sei., 2, 39 (1967).
  75. Lazarus H. M.,Sporn M. В., Purification and properties of a nuclear exoribonuclease from Ehrlich ascites tumour cells, Proc. natn. Acad. Sei., USA, 57, 1386 (1967).
  76. SchützG., Gallwitz D., Sekeris С. E., Rapidly labelled high molecular RNA from rat liver, Eur. /. Biochem., 4, 149 (1968).
  77. Kijima S., WiltF. H., Rate of nuclear ribonucleic acid turno­ver in sea urchin embryos, J. molec. Biol., 40, 235 (1969).
  78. Hogness D. S., Cohn M., MonodJ., Studies on the induced synthesis of ß-galactosidase; the kinetics and mechanism of sulp­hur incorporation, Biochim. biophys. Acta, 16, 99 (1955).
  79. RotmanВ., Spiegelman S., On the origin of the carbon in the induced synthesis of ß-galactosidase in Escherichia coli, J. Bact., 68, 419 (1954).
  80. Koch A. L., Levy H. R.,Protein turnover in growing cultures of Escherichia coli, J. biol. Chem., 217, 947 (1955).
  81. Harris H.,Watts J. W., Turnover of protein in a nonmultip­lying animal cell, Nature, Lond., 181, 1582 (1958).
  82. MandelstamJ., Turnover of protein in growing and nongrowing populations of Escherichia coli, Biochem. J., 69, 110 (1958).
  83. Eagle H., Piez K. A., Fleischman R., Oyama V. I.,Pro­tein turnover in mammalian cell cultures, J. biol. Chem., 234, 592 (1959).
  84. Mandelstam J.,The intracellular turnover of protein and nuc­leic acids and its role in biochemical differentiation, Bact. Rev., 24, 289 (1960).
  85. Schimke R.Т., The importance of both synthesis and degrada­tion in the control of arginase levels in rat liver, J. biol. Chem., 239, 3808 (1964).
  86. Schimke R.Т., Sweeney E. W., Berlin С. М., An analysis of the kinetics of rat liver tryptophan induction: the significance of both enzyme synthesis and degradation, Biochem. biophys. Res.Commun., 15, 214 (1964).
  87. Bishop J. O.,The effect of genetic complexity on the timecourse of RNA—DNA hybridization, Biochem. J., 113, 805 (1969).
  88. Melli M., Bishop J. D.,Hybridization between rat liver DNA and complementary RNA, J. molec. Biol., 40, 117 (1969).
  89. Bishop J. O., Robertson F. W., Burns J. A., Melli M.,Me­thods for the analysis of deoxyribonucleic acid-ribonucleic acid hybridization data, Biochem. J., 115, 361 (1969).
  90. Bishop J. O.,Examination of an equilibrium interpretation of deoxyribonucleic acid-ribonucleic acid hybridization data, Bio­chem. J., 116, 223 (1970).