2 years ago
No comment

Sorry, this entry is only available in
Russian
На жаль, цей запис доступний тільки на
Russian.
К сожалению, эта запись доступна только на
Russian.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

  1. Гибридизация клеток, принадлежащих к разным видам

Эту главу я собираюсь посвятить вопросу, которым за­нимаюсь непосредственно сам. Проводимые нами работы имеют отношение к трем основным проблемам: 1) природе и специфичности цитоплазматических сигналов, регули­рующих синтез РНК в ядрах соматических клеток; 2) ме­ханизму репрессии синтеза ядерной РНК; 3) механизму передачи генетической информации из ядра в цитоплазму. Исследования начались в 1965 году с опыта, который мы поставили вместе с Дж. Ф. Уоткинсом [1]. Мы показали, что вирус животных, после инактивации ультрафиолетовы­ми лучами, может быть использован для индукции слия­ния клеток мыши и человека и образования их гиб­ридов (Спонтанная гибридизация соматических клеток млекопитаю­щих была обнаружена Барским и др. в 1960 году. (Acad. Sei. 251, № 17, 1825, 1960.)). Мысль использовать для этой цели вирусы возник­ла в связи с наблюдениями, сделанными более ста лет назад [20]. Давно известно, что при многих заболеваниях в пораженных тканях обнаруживаются многоядерные клет­ки. В медицинской литературе XIX века велась длительная и оживленная полемика о механизмах их образования. Многоядерные клетки находят главным образом в очагах поражений, вызванных некоторыми патогенными вирусами. В последнее десятилетие стало ясно, что, по крайней мере в некоторых случаях, вирус вызывает появление много-ядерных элементов, индуцируя слияние отдельных клеток. Оставалось сделать всего один шаг, а именно узнать, нель­зя ли использовать вирус для того, чтобы индуцировать слияние клеток разных типов, а также выяснить, будут ли жизнеспособными гибриды, если они вообще образуются. Поскольку при заражении живым вирусом гибриды могли погибнуть, обработку производили убитым вирусом. При этом оказалось, что вирус, инактивированный ультрафиолетовыми лучами, можно использовать для индукции слияния дифференцированных и недифференцированных клеток разных видов и даже разных классов позвоноч­ных [3, 4]. Такой метод дал возможность получать межви­довые гибридные клетки, которые длительное время жили в культуре и во многих случаях обладали способностью к неограниченному размножению [5, 6]. По этой причине они оказались удобной моделью для изучения ядерно-плазменных отношений и дали возможность поставить такие опыты, которые раньше были нереальны. Результа­ты некоторых опытов я намереваюсь обсудить.

В работе использовали миксовирус Сендай из подгруп­пы парагриппа, так как, по данным Окада [7], было извест­но, что высокие дозы этого вируса стимулируют слияние опухолевых клеток животных. Предварительно вирус облу­чали такой дозой ультрафиолетового света, которая не влияла на его способность индуцировать слияние клеток, но снижала инфекционность в миллион раз. На начальном этапе работы исследовали клетки двух типов: HeLa (клет­ки человека, много лет растущие в культуре) и клетки асцитной опухоли Эрлиха (опухолевые клетки мыши, свободно размножающиеся в брюшной полости).

Эти два типа клеток были выбраны по ряду чисто тех­нических причин, но главным образом потому, что их ядра легко отличить по морфологическим признакам. Когда суспензию, содержащую смесь этих клеток, обрабатывают при соответствующих условиях инактивированным виру­сом, клетки собираются в группы. На электронных микро­фотографиях на поверхностях соседних клеток между пе­реплетающимися микроворсинками видны вирусные час­тицы [8]. Если клетки инкубировать при 37° С, то оболочки слипшихся клеток в местах контакта растворяются и меж­ду клетками образуются цитоплазматические мостики (фото IV). Число таких мостиков увеличивается до тех пор, пока цитоплазма соседних клеток не сольется полностью и не образуются многоядерные клетки, число ядер в которых может быть разным (фото V, А).

Тонкий цитоплазматический мостик...

Тонкий цитоплазматический мостик…

Многоядерная клетка...

Многоядерная клетка…

Когда такие клетки помещают в культуральный сосуд, они оседают на дно сосуда или на помещенные в него по­кровные стекла и через 3—4 ч распластываются по поверх­ности стекла. При изучении окрашенных препаратов выяснилось, что во многих клетках содержатся как ядра кле­ток HeLa, так и ядра клеток асцитной опухоли Эрлиха.

Для того чтобы окончательно доказать, что многоядер­ные клетки в самом деле представляют собой гетерокарионы (т. е. содержат ядра разных типов клеток), популяцию клеток HeLa выращивали в присутствии меченного трити­ем тимидина до тех пор, пока ядра практически всех клеток не включали метку; затем суспензию, содержащую эти меченые клетки HeLa и немеченые клетки асцитной опухоли Эрлиха, обрабатывали вирусом. Образовавшимся многоядерным клеткам давали возможность прикрепиться к покровному стеклу и затем готовили препараты для полу­чения радиоавтографов. На радиоавтографах было видно, что многоядерные клетки содержат как меченые, так и немеченые ядра, причем меченые ядра обладали мор­фологическими признаками ядер HeLa, а немеченые — признаками клеток асцитной опухоли Эрлиха (фото V, Б). Таким образом, не оставалось сомнения, что под влиянием вируса образуются гибриды, содержащие одновременно ядра клеток человека и мыши.

  1. Синтез макромолекул в гибридных клетках

Далее было интересно выяснить, каковы возможности гибридных клеток: способны ли они синтезировать белок, РНК, ДНК и могут ли они делиться? С помощью 3Н-лей­цина удалось установить, что белок в них действительно синтезируется, причем интенсивность метки и характер распределения зерен в цитоплазме гибридов были такими же, как и в соседних одноядерных клетках. После обработки гибридных клеток в течение нескольких минут меченым предшественником РНК метка обнаруживается в обоих типах ядер гетерокариона. Значит, в этих клетках считываются гены и человека, и мыши. При более длительной инкубации с меченым предшественником РНК метка выявляется также и в цитоплазматической РНК. Следова­тельно, синтез РНК в гетерокарионах подчиняется тем же закономерностям, что и в одноядерных клетках, за од­ним исключением — в гетерокарионе в этом процессе одно­временно участвуют ядра клеток человека и мыши. Обработка 3Н-тимидином показала, что в ядрах обоих ти­пов синтезируется также и ДНК. Сначала синтез ДНК в ядрах гетерокарионов происходит не одновременно, но постепенно этот процесс синхронизируется. Особенно легко синхронизация синтеза ДНК достигается в многоядерных клетках с одинаковыми ядрами. Наблюдается она и в ге­терокарионах; однако в некоторых случаях при слиянии клеток очень далеких видов животных синхронизация син­теза ДНК может не наступить. В клетках, содержащих всего два ядра, наблюдается, как правило, более полная синхронизация, чем в клетках, где число ядер больше [9-11].

  1. Образование и поведение одноядерных гибридных клеток

Хотя многоядерные клетки, образовавшиеся в результа­те слияния, при благоприятных условиях сохраняют жиз­неспособность в течение нескольких недель, способность же к дальнейшей репродукции зависит от образования одноядерных дочерних клеток. Дочерние клетки могут об­разовываться разными способами, но каковы бы ни были эти способы, все они характеризуются слиянием отдельных ядер гетерокариона в одно более крупное ядро. Такое слия­ние происходит во время митоза. В двухъядерной клетке при синхронном митозе обычно образуется одно веретено деления. Все хромосомы располагаются в общей метафазной пластинке. В результате деления образуются две до­черние одноядерные клетки, содержащие в своих ядрах хромосомы обеих родительских клеток (фото VI). Встречаются также и другие типы митозов, осо­бенно часто трех- и четырехполюсные, при которых возникает различное число дочерних клеток, причем неко­торые из них оказываются двухъядерными. Иногда ядра гетерокариона вступают в митоз, но сама клетка при этом не делится: после митоза все хромосомы могут объединить­ся либо в одно очень крупное ядро, либо образуются два ядра, каждое из которых содержит хромосомы обоих роди­телей. В гетерокарионах, содержащих больше двух ядер, абортивные и неправильные митозы происходят чаще, тем не менее и в этих условиях все же иногда возникают дочерние клетки, содержащие хромосомы разных родительских клеток. Таким образом, существует несколько способов образования из гетерокарионов дочерних гибридных клеток с одним ядром, содержащим генетический материал обеих исходных клеток.

Деление гетерокариона...

Деление гетерокариона…

Эти одноядерные гибридные клетки также синтезируют белок, РНК, ДНК и в положенное время приступают к де­лению; при анализе метафазных пластинок было обнару­жено, что соотношение хромосом обоих родителей бывает в них разным (фото VII, А). Многие одноядерные гибрид­ные клетки способны к неограниченному размножению, причем в большинстве случаев видовые различия между родительскими клетками, по-видимому, не влияют на их способность к репродукции. Благодаря применению вируса удалось произвести гибридизацию клеток мыши и хомяч­ка [12], мыши и человека [13, 14] и даже мыши и цыплен­ка [15] и получить одноядерные гибридные клетки, способ­ные к неограниченному размножению. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что клетки самых раз­ных видов позвоночных при слиянии в единое целое впол­не совместимы друг с другом. Очевидно, у них нет внутриклеточных механизмов для распознавания чужого, подобных тем, которые ответственны за узнавание и оттор­жение тканей или органов, пересаженных от одного инди­видуума к другому, причем к такому «дружественному» объединению способна не только цитоплазма разных кле­ток, но также и ядро. Функции сложной гибридной клетки, образующейся после слияния ядер, полностью интегри­рованы.

Гибрид HeLa...

Гибрид HeLa…

  1. Гибриды, получающиеся при слиянии дифференцированных клеток

Я описал гибриды, образующиеся при слиянии клеток, каждая из которых способна к синтезу РНК, ДНК и к де­лению, но можно также получить гетерокарионы из кле­ток, в которых частично или полностью подавлен синтез либо ДНК, либо РНК, либо обеих этих нуклеиновых кислот вместе. Клетки, неспособные синтезировать ДНК или РНК, можно объединить друг с другом или с клетками, в которых синтез этих кислот протекает нормально. Такие типы гетерокарионов особенно удобно использовать при изучении цитоплазматических сигналов, регулирующих синтез РНК в ядрах животных клеток, а также механиз­мов, осуществляющих эту регуляцию.

Для исследования были выбраны три типа высокодифференцированных клеток: макрофаги кролика, лимфоциты крысы и эритроциты курицы. Макрофаги — подвижные фагоцитирующие клетки, основная функция которых — очистка тканей организма от продуктов распада. Эти клет­ки можно выделить в больших количествах из брюшной полости кролика путем некоторых экспериментальных воз­действий. Ядро клеток имеет овальную или бобовидную форму. Макрофаги, выделенные из брюшной полости кро­лика, синтезируют РНК, но не синтезируют ДНК и не де­лятся ни в организме, ни in vitro [16].

Лимфоциты представляют собой мелкие клетки с плот­ным компактным ядром, окруженным очень небольшим количеством цитоплазмы. Чистую популяцию малых лим­фоцитов можно получить из грудного лимфатического про­тока крысы. Малые лимфоциты синтезируют неодинаковое количество РНК: после инкубации в течение 1 ч с радио­активным предшественником РНК, взятым в очень высо­кой концентрации, в некоторых клетках метка практически отсутствует, т. е. в них почти не синтезируется РНК, тогда как в других лимфоцитах в этих же условиях включается значительное количество предшественника [17]. Обычно малые лимфоциты не синтезируют ДНК и не делятся, но они могут начать синтезировать ДНК и делиться, если их обработать антигеном [18]. В этом случае они превращают­ся в клетки, играющие главную роль в иммунном ответе организма.

Эритроциты большинства млекопитающих, как прави­ло, утрачивают ядра в процессе созревания, эритроциты же птиц, амфибий, рептилий, а также некоторых млекопитаю­щих сохраняют ядро в течение всего жизненного цикла клетки. Зрелые эритроциты курицы, содержащие ядро, не синтезируют заметных количеств РНК [19] и ДНК и не де­лятся. Это предельно дифференцированные, так называе­мые «конечные» клетки. После определенного периода циркуляции в крови они разрушаются. Поэтому казалось интересным узнать, особенно это касается эритроцитов, содержащих ядра, обратимы ли изменения, возникающие в процессе дифференцировки. Можно ли заставить инерт­ную или частично инактивированную клетку возобновить синтез РНК, ДНК или обеих этих нуклеиновых кислот, если объединить ее в гетерокарионе с клеткой, нормально синтезирующей нуклеиновые кислоты?

Меняя количественное соотношение двух типов клеток и концентрацию инактивированного вируса, в определен­ных пределах удается контролировать число и соотношение типов ядер в гетерокарионах. На фотографии VII, Б пред­ставлен гетерокарион, образовавшийся в результате слия­ния одной клетки HeLa с девятью макрофагами кролика, а на фотографии VIII, А показан гетерокарион, образован­ный тремя клетками HeLa и двумя лимфоцитами крысы. Если в культуру гетерокарионов HeLa — макрофаги кроли­ка на короткий срок добавить меченный тритием предшест­венник РНК, то оказывается, что синтез РНК идет в обоих типах ядер; об этом можно судить по радиоавтографам, полученным с препаратов, фиксированных соответствую­щим образом. При более длительной инкубации с мечены­ми предшественниками, как обычно, метка выявляется также и в цитоплазматической РНК.

Следовательно, в этих гетерокарионах, как и в гетеро­карионах HeLa — клетка Эрлиха, в синтезе РНК прини­мают участие и те и другие ядра. Такой результат не уди­вителен; известно, что и клетки HeLa, и макрофаги спо­собны синтезировать РНК. Гораздо интереснее тот факт, что при инкубации гетерокарионов, образованных макро­фагами и клетками HeLa, с меченым тимидином метка включается не только в ядра клеток HeLa, но и в ядра макрофагов. Если через сутки после слияния клеток ввести в среду на 1 ч меченый тимидин, то в гетерокарионах оказываются мечеными более 80% ядер макрофагов. Из этого следует, что неспособность макрофагов синтези­ровать ДНК, а значит, и реплицировать свой генетический материал, обратима: после слияния макрофага с клеткой HeLa в его ядре вновь начинается синтез ДНК.

Такой же результат был получен при исследовании ге­терокарионов HeLa — малые лимфоциты крысы. Для того чтобы практически все ядра HeLa и лимфоцитов в этих гетерокарионах оказались мечеными, достаточно всего на 20 мин ввести в среду 3Н-уридин. А поскольку даже после часовой экспозиции с радиоактивными предшествен­никами РНК, взятыми к тому же в очень высокой концент­рации, почти половина малых лимфоцитов, выделенных из грудного протока, остается немеченой, очевидно, что мно­гие ядра лимфоцитов в гетерокарионе получили сигнал к возобновлению или, по крайней мере, к резкому увели­чению синтеза РНК. Когда же к гетерокарионам HeLa — лимфоциты добавили 3Н-тимидин, оказалось, что не толь­ко в ядрах клеток HeLa, но и в ядрах лимфоцитов синте­зируется ДНК.

Еще более поразительны результаты, полученные при изучении гетерокарионов HeLa — куриные эритроциты (фото VIII, Б). В зрелых куриных эритроцитах меченые предшественники не включаются в РНК и ДНК в таком количестве, которое можно определить с помощью радио­автографии. Даже когда эти клетки несколько часов инку­бируют в присутствии высоких концентраций меченных три­тием рибонуклеозидов или тимидина, на радиоавтографах, полученных соответствующим образом, не наблюдается достоверно меченных ядер. Однако если с меченым уридином инкубируют гетерокарионы HeLa — куриные эри­троциты даже в течение всего лишь 15—20 мин, то оказы­вается, что не только в ядрах HeLa, но и в большинстве ядер эритроцитов синтезируется РНК. Следовательно, можно заключить, что в этих гетерокарионах восстанавли­вается генетическая активность обычно инертных ядер эритроцитов. С помощью меченого тимидина удалось по­казать, что в гетерокарионах многие ядра эритроцитов возобновляют также и синтез ДНК [10]. Так как из всех клеток позвоночных, содержащих ядра, эритроциты птиц представляют собой одну из самых дифференцированных форм, можно, по-видимому, сделать вывод, что пока в клет­ке есть ядро, все ограничения, которые дифференцировка накладывает на синтез нуклеиновых кислот, в значитель­ной мере обратимы.

Гетерокарион...

Гетерокарион…

Можно также предположить, что возобновление синтеза РНК и ДНК происходит не потому, что покоящиеся или частично инактивированные ядра эритроцитов попадают в цитоплазму клетки, в которой содержатся инструкции для синтеза нуклеиновых кислот в своем собственном ядре, а только потому, что они оказались в чужой цитоплаз­ме: восстановление их активности рассматривается тогда как неспецифичная реакция на «чужеродное» окружение. Это предположение можно проверить разными способами, например исследовать гетерокарионы, образовавшиеся при слиянии дифференцированных клеток. Так, если получить гетерокарионы макрофаг кролика — лимфоцит крысы или макрофаг кролика — куриный эритроцит, то все ядра ока­жутся в чужой или в частично чужой цитоплазме; получен­ные гетерокарионы отличаются от гетерокарионов, обра­зовавшихся при слиянии любой из этих клеток с клетками HeLa, тем, что обе родительские клетки не синтезируют ДНК. Поэтому мы вправе ожидать, что с помощью таких гетерокарионов удастся выяснить, действительно ли вос­становление синтеза ДНК в покоящемся ядре определяется чужеродностью цитоплазмы гетерокариона или же дело здесь в чем-то ином.

На фотографии IX, Б показан гетерокарион, содержа­щий три ядра макрофагов кролика и два ядра лимфоцитов крысы; на фотографии IX, А — гетерокарион с четырьмя ядрами макрофагов кролика и тремя ядрами эритроцитов курицы. Можно видеть, что ядра в этих гетерокарионах располагаются в виде розетки по периферии цитоплазмы. Периферическое расположение ядер в определенных типах многоядерных клеток впервые отметил Ланганс, поэтому, когда в патологических условиях обнаруживают подобные клетки, их обычно называют клетками Ланганса. Такая своеобразная морфология, по-видимому, характерна для гетерокарионов, основным клеточным элементом которых являются макрофаги. Если гетерокарионы макрофаг — лимфоцит обработать 3Н-уридином, то оказывается, что в ядрах обоих типов синтезируется РНК. Следовательно, в клетке вновь активны оба набора генов. В гетерокарионах макрофаг — эритроцит наблюдается такая же картина: в ядрах обоих типов синтезируется РНК. Таким образом, цитоплазма макрофага кролика, как и цитоплазма клет­ки HeLa, способна стимулировать восстановление генети­ческой активности в покоящемся ядре эритроцита.

Гетерокарион...

Гетерокарион…

Но ни один из этих гетерокарионов не синтезирует ДНК и не делится: сколько бы их ни инкубировали с ме­ченным тритием тимидином, метка не включается ни в одно из ядер. C другой стороны, если в гетерокарионе объ­единить эритроциты куриного зародыша с фибробластами того же самого зародыша, в ядрах эритроцитов возобновит­ся синтез ДНК, несмотря на то что они находятся не в «чужой», а в «своей» цитоплазме. Значит, покоящиеся ядра возобновляют синтез ДНК в гетерокарионе не потому, что они оказались в «чужой» цитоплазме, а потому, что эта цитоплазма дает им соответствующие инструкции. Когда же ядро эритроцита попадает в цитоплазму макрофага, который обычно синтезирует РНК, а не ДНК, в ядре эри­троцита также индуцируется синтез именно РНК, а не ДНК.

Результаты опытов с дифференцированными клетками приведены в табл. 1. При анализе этих опытов выявляются следующие закономерности: 1) если одна из родительских клеток способна синтезировать РНК, то синтез РНК будет происходить в обоих типах ядер гетерокариона; 2) если одна из родительских клеток способна синтезировать ДНК, то синтез ДНК будет происходить в обоих типах ядер гетерокариона; 3) если ни одна из родитель­ских клеток в норме не синтезирует ДНК, то и гетерокари­он также не будет способен к синтезу ДНК. Следовательно, в гетерокарионе регуляция синтеза нуклеиновых кислот происходит всегда только таким образом, что при слиянии клетки, способной к синтезу какой-либо нуклеиновой кислоты, с клеткой, не синтезирующей этой кислоты, ак­тивная клетка вызывает такой же синтез у инертного парт­нера. Инертная клетка никогда не подавляет синтез у активного партнера, даже в гетерокарионах, образованных множеством инертных клеток — макрофагов — с одной активной — клеткой HeLa (фото VII, Б). Если применить современную терминологию, используемую для описания подобных явлений у бактерий, то в этой ситуации можно сказать, что синтез ДНК и РНК находится под позитив­ным контролем.

  1. Природа цитоплазматических сигналов

Для изучения природы цитоплазматических сигналов, которые включают синтез нуклеиновых кислот в покоя­щихся или частично инактивированных ядрах, особенно важны гетерокарионы, содержащие ядра куриных эритро­цитов. Все другие описанные мною гетерокарионы обра­зуются при слиянии двух клеток и содержат поэтому не только ядра, но и цитоплазму обоих родителей. Этого нель­зя сказать о гетерокарионах, одна из родительских клеток которых — ядерный эритроцит. Дело в том, что вирус Сендай — гемолитический вирус, и при высоких концентра­циях, которые используются для индукции слияния кле­ток, происходит лизис цитоплазмы эритроцитов (гемолиз); в результате этого эритроциты превращаются в так назы­ваемые «тени», состоящие почти исключительно из ядер и поврежденных клеточных мембран.

Если суспензию, содержащую куриные эритроциты и клетки человека или мыши, растущие в культуре, обрабо­тать вирусом и затем сделать электронные микрофотогра­фии, то можно увидеть скопления теней эритроцитов и культуральных клеток; между их соприкасающимися ободочками находятся вирусные частицы (фото X, А). Как всегда, под влиянием вируса между клетками образуются цитоплазматические мостики. Через эти мостики цито­плазма клеток человека или мыши перетекает в эритроцит, заполняя пространство, освободившееся от его собственной цитоплазмы в результате гемолиза (фото X, Б). Затем мем­брана культуральной клетки растворяется в месте контакта с эритроцитом, и ядро эритроцита входит в цитоплазму этой клетки (фото XI, А, Б). Следовательно, в данном слу­чае гетерокарион образуется путем включения лишенного цитоплазмы ядра эритроцита в цитоплазму клетки челове­ка или мыши.

"Тень" эритроцита

“Тень” эритроцита

Ядро эритроцита...

Ядро эритроцита…

Тот факт, что гибридные клетки способны функциони­ровать как единое целое, не мало говорит нам о механиз­мах, регулирующих активность генов. Во всяком случае мы можем быть уверены, что сигналы, посылаемые цито­плазмой гибридной клетки одному из геномов, восприни­маются другим геномом и воспринимаются правильно: если бы эти сигналы для одного из ядер гетерокариона были «ложными», то в конечном счете наблюдались бы прогрес­сирующие нарушения в обмене веществ всего гетерокарио­на. Однако известно, что на самом деле некоторые межви­довые гибридные клетки размножаются даже быстрее, чем каждая из родительских клеток в отдельности. Поэтому предположение о том, что один из геномов неправильно воспринимает сигналы гибридной цитоплазмы, можно от­клонить. Остается предположить, что либо каждый набор генов реагирует на сигналы только своей собственной ци­топлазмы, либо сигналы, посылаемые гибридной цитоплаз­мой, одинаково действуют на оба генома. То, что ядра эритроцитов можно вводить в другие клетки и при этом не вносить в них значительного количества цитоплазмы, по­зволяет нам выяснить, какое из этих двух предположений правильно.

Опыты, которые я здесь описал, показывают, что для реактивации ядра куриного эритроцита не требуется учас­тия его собственной цитоплазмы. Активность ядра эритро­цита, лишенного цитоплазмы в результате гемолитического действия вируса Сендай, восстанавливается в цитоплазме клеток самых разных видов животных — от мыши до че­ловека. В этих клетках можно реактивировать также ядра эритроцитов лягушки [2]. Следовательно, ядра эритроцитов действительно отвечают на сигналы, исходящие из совер­шенно чужой для них цитоплазмы. Такая удивительно полная интеграция при образовании межвидовых гибрид­ных клеток была бы невозможна, если бы каждый набор генов отвечал на сигналы лишь своей собственной цито­плазмы. Восстановление активности ядра эритроцита в цитоплазме клетки человека или мыши проявляется не только в возобновлении синтеза нуклеиновых кислот, но, как я покажу дальше, также и в упорядоченном синтезе специфичных белков, детерминируемых этими ядрами. Итак, мы можем прийти к заключению, что сигналы, исхо­дящие из цитоплазмы клетки человека или мыши, воспри­нимаются ядром куриного эритроцита совершенно правиль­но. Иначе говоря, эти цитоплазматические сигналы не ви­доспецифичны.

Соотношение между максимальными размерами поперечных сечений ядер эритроцитов...

Соотношение между максимальными размерами поперечных сечений ядер эритроцитов…

Наиболее заметным морфологическим событием, свя­занным с реактивацией ядра эритроцита, является резкое увеличение его объема [21]. Хотя точное измерение объема ядра затруднительно, тем не менее очевидно, что оно уве­личивается по крайней мере в 20—30 раз [22]. Набуха­ние ядра сопровождается дисперсией его сильно конденси­рованного хроматина, что легко обнаружить с помощью со­ответствующих цитологических методик (фото XI, В и XII, А). Если такие гетерокарионы инкубировать в течение не­скольких минут с радиоактивным предшественником РНК, то с помощью метода радиоавтографии можно показать, что количество РНК, синтезируемой реактивированным ядром эритроцита в единицу времени, прямо пропорцио­нально увеличению его объема (фото XII, Б). Как показа­но на фиг. 7, количество РНК, синтезированной ядром эритроцита, является простой функцией от его объема; в тех же эритроцитах, в которых ядра не увеличились, РНК не синтезируется. Увеличение ядра объясняется не только всасыванием воды: одновременно в 4—6 раз возрастает сухая масса ядра, в основном за счет увеличения содержа­ния белка [22]. Если перед образованием гетерокарионов облучить эритроциты большой дозой ультрафиолетового света, синтез нуклеиновых кислот в их ядрах не возобнов­ляется, но размер таких облученных ядер тем не менее увеличивается, как обычно [21]. Это означает, что набуха­ние ядер в процессе реактивации не связано с синтезом и накоплением в них РНК и ДНК. Следовательно, увеличе­ние ядра — событие, которое управляет синтезом нуклеи­новых кислот.

Гетерокарион...

Гетерокарион…

Я только что отметил, что сухая масса ядер эритроци­тов, в которых синтез РНК подавлен ультрафиолетовыми лучами, увеличивается так же, как и у необлученных ядер [23]. Облученные ядра не могут синтезировать свои соб­ственные белки, поэтому увеличение их сухой массы обус­ловлено, по всей вероятности, притоком белков из гибридной цитоплазмы. Несомненно, это белки клеток мыши или человека, которые тем не менее способны вызвать в ядре куриного эритроцита соответствующие процессы. Так как ядро эритроцита в гетерокарионе определяет синтез имен­но куриных белков, то, следовательно, такое ядро функцио­нирует, и функционирует совершенно нормально в окруже­нии чужеродных белков.

Дисперсия хроматина, происходящая при увеличении ядра эритроцита, сопровождается некоторыми изменения­ми его структуры, которые могут быть выявлены цитохи­мическими методами. Наиболее важное из этих изменений состоит в увеличении сродства хроматина к интеркалярным красителям, таким, как акридиновый оранжевый и этидий-бромид [22]. Еще до начала репликации ДНК количество связанного хроматином красителя увеличивается прибли­зительно в 4 раза и в дальнейшем по мере набухания ядра продолжает нарастать. Аналогичные результаты были по­лучены в опытах с эктиномицином D при определении спо­собности этого антибиотика связываться с транслирующи­мися участками ДНК [24]. В процессе реактивации хрома­тина увеличивается его чувствительность к тепловой денатурации, что обнаруживают по изменению кривой плав­ления [22]. Все эти наблюдения свидетельствуют о том, что увеличение ядра сопровождается разрыхлением хроматина, которое делает его более доступным не только для неболь­ших молекул, таких, как акридиновые красители или актиномицин D, но и для макромолекул. Несомненно, этот же процесс делает хроматин более доступным для молекул, участвующих в его транскрипции, так что, чем больше разрыхляется исходно конденсированный хроматин, тем большая его часть считывается.

Многие цитохимические изменения, которые претерпе­вает ядро эритроцита при реактивации в гетерокарионе, можно вызвать искусственно в тенях эритроцитов, если их обработать при определенных условиях агентами типа хелатов, связывающими двухвалентные катионы [22, 25]. Таким образом, вполне вероятно, что в ядрах эритроцитов, так же как и в ядрах других эукариотических клеток, од­ним из механизмов, регулирующих транскрипцию ДНК, является взаимодействие хроматина с двухвалентными катионами и другими электролитами. Я уже упоминал (см. гл. IV), что процессы изменения размеров ядра, по­явления конденсированных Х-хромосом и образования дополнительных хромоцентров в соматических клетках не­которых позвоночных определенным образом связаны друг с другом [26—28]; я обсудил также, каким образом изменение баланса электролитов в среде может вызывать избирательную конденсацию хроматина и, следовательно, инактивацию разных частей генома. Результаты изучения ядер эритроцитов, реактивированных в гетерокарионах, полностью подтверждают точку зрения, что генетическая активность регулируется с помощью избирательной кон­денсации и дисперсии хроматина, а связь между синте­зом РНК и размерами ядра свидетельствует о том, что из­менение этих размеров представляет собой часть единого механизма, обеспечивающего последовательное включение и выключение соответствующих участков генетического материала. Во всяком случае, если местное изменение ба­ланса электролитов действительно вызывает реактивацию покоящегося ядра эритроцита, то совсем не удивительно, что такая реактивация происходит в цитоплазме клеток животных самых разных видов. С этой точки зрения сиг­налы, поступающие в ядро куриного эритроцита из цито­плазмы клеток человека или мыши, должны иметь самый общий характер, и, по всей вероятности, они одинаковы у всех клеток позвоночных.

  1. Перенос информации из ядра в цитоплазму. Результаты опытов по возобновлению активности ядер эритроцитов

Гетерокарионы, одна из родительских клеток кото­рых — ядерный эритроцит, дают нам блестящую возмож­ность для изучения механизма реализации генетической информации в цитоплазме клеток млекопитающих. Восста­новление активности ядер эритроцитов, которая до слияния клетки была полностью подавлена, происходит довольно медленно, что позволяет подробно изучать каждую стадию этого процесса. Реактивированные ядра можно в любой момент извлечь из гетерокариона и исследовать синтезиро­ванную ими РНК; можно также наблюдать переход этой РНК в цитоплазму и исследовать связь между транскрип­цией генов и синтезом соответствующих белков. Короче говоря, с помощью гетерокарионов процесс передачи ин­формации можно изучать с такой точностью, которая вряд ли возможна при работе с любым другим биологическим объектом. В этом разделе будут представлены результаты такого анализа.

При изучении любого белка, синтез которого опреде­ляется ядром куриного эритроцита, реактивированного в цитоплазме мышиной или человеческой клетки, необходи­мо прежде всего доказать, что исследуемый белок именно куриный, а не мышиный или человеческий. Поэтому пер­выми для изучения в гетерокарионах были выбраны белки, представляющие собой видоспецифичные поверхностные антигены [29]. Их выявляют на поверхности клеток, растущих в культуре, с помощью высокоспецифичного и очень чувствительного метода гемадсорбции [30, 31] с при­менением смеси антиглобулинов [32]. В качестве маркеров используются сенсибилизированные эритроциты, которые антисывороткой прикрепляются к тем точкам поверхности гетерокариона, где находятся куриные антигены. Если пра­вильно подобрать разведение антисыворотки, то можно из­бежать перекрестной реакции между куриными и мыши­ными (или человеческими) антигенами, поэтому адсорб­цию эритроцитов на поверхности гетерокарионов можно считать доказательством того, что на ней находятся кури­ные антигены.

Поскольку такие гетерокарионы образуются в резуль­тате включения тени эритроцита в клетку-реципиент, сра­зу же после слияния на поверхности гетерокариона появ­ляются компоненты мембраны эритроцита, которые выявля­ются с помощью реакции гемадсорбции [8] (фото XIII, А). В течение первых нескольких дней после слияния ан­тигены ведут себя крайне необычно. Так как в это время ядро куриного эритроцита возобновляет активность и на­чинает синтезировать большие количества РНК, то следо­вало бы ожидать, что количество куриных антигенов на поверхности гетерокариона должно увеличиваться. Но в действительности оказалось, что антигены постепенно исчезают с поверхности клеток и на 4-й день у большин­ства гетерокарионов их уже нельзя обнаружить (фото XIII, Б). При анализе этого явления выяснилось, что ис­чезновение видоспецифичных куриных антигенов с по­верхности гетерокарионов объясняется постепенным вы­теснением их антигенами мыши (или человека), которые продолжает синтезировать клетка-реципиент. И хотя все это время в ядрах эритроцитов образуются значительные количества РНК, на поверхности гетерокарионов новые видоспецифичные куриные антигены не появляются. Не из­меняется и скорость исчезновения антигенов, встроивших­ся в мембрану в процессе образования гетерокариона.

Гетерокарион...

Гетерокарион…

В одном очень важном отношении реактивацию ядер эритроцитов в первые два-три дня после слияния клеток можно считать неполноценной: несмотря на то что они заметно увеличиваются в размерах и возобновляют синтез ДНК и РНК, нормальные ядрышки в них не возникают (фото ХII, Б). На третий, а иногда на второй день после слия­ния в некоторых ядрах появляются мелкие структуры, ко­торые в световом микроскопе напоминают рудиментарные ядрышки, но не обладают признаками, характерными для ядрышек обычных культуральных клеток. Так как эритро­циты берут у нормальных кур, нет оснований считать, что у них имеется какой-то генетический дефект. Остается предположить, что либо цитоплазма клетки мыши (или че­ловека) не совсем подходящая среда для ядер куриных эритроцитов, либо эти гетерокарионы живут не столь дол­го и ядрышко просто не успевает полностью развиться. В первые четыре дня почти все гетерокарионы вступают в митоз, после которого ядра эритроцитов так или иначе пе­рестают существовать как обособленные структуры. Для увеличения продолжительности жизни ядер эритроцитов с тем, чтобы в них успели сформироваться ядрышки, клет­ку-реципиент облучали определенной дозой γ-лучей. Облу­ченные клетки продолжали расти примерно три недели и не вступали в митоз; таким образом создавались условия для более полного развития ядер эритроцитов как самосто­ятельных элементов гетерокариона. В этих условиях яд­рышки в ядрах эритроцитов начинали появляться на тре­тий день и затем постепенно увеличивались в размерах. К одиннадцатому дню более 80% ядер эритроцитов содер­жали одно или два легко распознаваемых ядрышка (фото XIV).

Гетерокарион...

Гетерокарион…

Видоспецифичные куриные антигены можно обнаружить на поверхности практически всех облученных гетерокарио­нов сразу же после слияния клеток или в течение последующих суток. Затем, как обычно, эти антигены начинают постепенно исчезать, и к шестому дню их не остается совсем. Однако на восьмой день в некоторых клетках вновь появляются куриные поверхностные антигены, причем сначала они обнаруживаются только на концах цитоплазматических отростков. В последующие дни число клеток, содержащих антиген, увеличивается, и теперь он распола­гается по всей периферии цитоплазмы. Количество анти­гена, приходящееся на каждую клетку (определяли методом гемадсорбции), продолжает расти до одиннадца­того дня, когда реакция происходит на всей поверхности большинства гетерокарионов, причем интенсивность этой реакции во много раз превышает ту, которая наблюдалась сразу после слияния клеток. Вся эта последовательность событий проиллюстрирована на фотографиях XIII, А, Б и XIV, а также представлена графически как функция от времени на фиг. 8.

Появление куриных видоспецифичных антигенов на поверхности гетерокарионов...

Появление куриных видоспецифичных антигенов на поверхности гетерокарионов…

Опыт с эритроцитами двенадцатидневных куриных за­родышей дал по существу аналогичные результаты, толь­ко весь процесс протекал быстрее. Уже на второй день после слияния клеток в ядрах эритроцитов начиналось образование ядрышек; и еще до полного исчезновения антигенов, встроившихся в мембрану при слиянии, появля­лись уже новые специфичные поверхностные куриные антигены (фиг. 9). Когда эритроциты брали у более моло­дых зародышей, ядрышки и новые поверхностные антиге­ны обнаруживали еще раньше. Во всех случаях наблюда­лась четкая связь между скоростью образования ядрышек и временем повторного возникновения на поверхности клеток видоспецифичных куриных антигенов. Следова­тельно, эти опыты показывают, что ядра куриных эритро­цитов могут активироваться в цитоплазме клеток живот­ных самых разных видов и способны контролировать в ней синтез видоспецифичных поверхностных антигенов, но такие реактивированные ядра не индуцируют образование антигенов до тех пор, пока в них не сформируются ядрышки.

Повторное появление куриных видоспецифичных антигенов...

Повторное появление куриных видоспецифичных антигенов…

Поскольку эти видоспецифичные антигены можно об­наружить только после их появления на поверхности клетки, нельзя исключить возможность того, что между временем их синтеза и временем, когда их удается выявить с помощью метода гемадсорбции, имеется лаг-период. Если этот лаг-период длится довольно долго, то связь между формированием ядрышек и синтезом поверх­ностных антигенов может быть просто случайной: антигены могут синтезироваться задолого до образования ядрышек. Поэтому очень важно было узнать, как ведут себя другие белки, синтез которых контролируется ядром эритроцита, особенно растворимые, не входящие в состав каких-либо структур. Естественно было выбрать для ис­следования растворимый фермент, и такой фермент был выбран — это пирофосфорилаза инозиновой кислоты, ка­тализирующая соединение гипоксантина и фосфорибозил­пирофосфата [33]. Так как фосфорилаза необходима для включения гипоксантина в нуклеиновые кислоты, ее со­держание можно определять как прямым способом (в гомогенатах клеток), так и косвенным (по включению мече­ного гипоксантина в интактные клетки). Этот фермент выбрали еще и потому, что имелась подходящая для рабо­ты, лишенная пирофосфорилазной активности линия мы­шиных клеток (линия Ад) [34].

Когда после инкубации клеток Ад с 3Н-гипоксантином делали радиоавтографы, в нуклеиновых кислотах обнаружи­вали лишь незначительное количество метки. Гетерокарионы, образовавшиеся при слиянии облученных клеток А9 и ядер эритроцитов, в первое время тоже включали очень мало гипоксантина. Увеличение размера и восстановление активности ядер эритроцитов ничего не меняло в этом от­ношении до тех пор, пока не появлялись ядрышки, после чего способность гетерокарионов включать гипоксантин резко возрастала, а во многих клетках при радиоавтографическом исследовании обнаруживалась меченая РНК. Эта последовательность событий показана на фотографиях XV, А, Б и XVI, А. Число ядер эритроцитов, в которых об­разовались ядрышки, а также включение гипоксантина в гетерокарионы в дальнейшем продолжали расти pari passu (фиг. 10). Однако во всех случаях, когда в ядрах эритро­цитов, входящих в состав гетерокарионов, не образовывались ядрышки, не увеличивалось и количество включенного гипоксантина (фиг. 11). Прямое определение фермента в гомогенатах подтвердило данные, полученные при радио­автографическом исследовании интактных клеток. В пер­вые дни активность пирофосфорилазы инозиновой кислоты в гетерокарионах очень низка, но когда в ядрах эритроци­тов начинают образовываться ядрышки, активность ее резко увеличивается и продолжает расти по мере развития ядрышек (фиг. 12). Электрофоретическое исследование пирофосфорилазы, синтезированной гетерокарионами, по­казало, что это фермент, специфичный для клеток курицы, а не для клеток мыши [35].

Активность пирофосфорилазы...

Активность пирофосфорилазы…

Сравнение двух типов гетерокарионов...

Сравнение двух типов гетерокарионов…

Активность пирофосворилазы...

Активность пирофосворилазы…

Радиоавтограф клетки А9...

Радиоавтограф клетки А9…

Радиоавтограф геторокариона А9...

Радиоавтограф геторокариона А9…

То, что растворимый белок появляется в гетерокарио­нах одновременно с видоспецифичным куриным поверх­ностным антигеном, делает маловероятным наличие неко­его лаг-периода (продолжительность которого соответст­вует временной шкале этих экспериментов) между синтезом антигена и его появлением на клеточной поверх­ности; мы, таким образом, пришли к выводу, что и фер­мент, и антиген, совершенно не связанные друг с другом ни в структурном, ни в функциональном отношении, начи­нают синтезироваться в гетерокарионе только после обра­зования ядрышек в ядре эритроцита и не ранее. Сам факт полного отсутствия зависимости между ферментом и анти­геном заставляет серьезней отнестись к мысли, что ответ­ственные за эти белки гены начинают считываться только после возникновения ядрышек в ядре эритроцита. Ведь трудно себе представить, почему транскрипция именно этих генов должна быть отложена на несколько дней, а затем вдруг одновременно начаться; у нас нет также осно­ваний считать, что эти конкретные белки принимают уча­стие в функционировании ядрышка. Пожалуй, имеется гораздо больше оснований предположить, что кинетика синтеза всех других белков эритроцита подобна кинетике синтеза этих двух белков и что способность ядра эритро­цита определять синтез любых белков зависит от развития ядрышка. Во всяком случае, это предположение послужи­ло отправным пунктом для дальнейших исследований.

Нет необходимости объяснять, насколько важно было выяснить, какие же типы РНК синтезируются в реактиви­рованных ядрах эритроцита до и после образования ядрышек. С этой целью был разработан метод, позволяющий выделять ядра из гетерокарионов и отделять ядра эритро­цитов от ядер клеток мыши (или человека) [29, 36]. Через различные промежутки времени после образования гете­рокарионов в среду добавляли меченые предшественники РНК. Затем методом центрифугирования в градиенте плот­ности сахарозы изучали РНК, синтезированную в каждом из двух типов ядер гетерокарионов. Оказалось, что ядра клеток мыши (или человека) образуют и «быстрометящую­ся, полидисперсную» РНК, и нормальные 28S- и 16S-ком­поненты РНК, тогда как ядра эритроцитов до появления в них ядрышек синтезируют лишь «полидисперсную» РНК: синтез 28S- и 16S-PHKначинается в них только после формирования ядрышек. Радиоавтографический анализ показал, что до образования ядрышка синтез полидисперс­ной РНК происходит grosso modo во всем объеме ядра эритроцита, и поэтому она, очевидно, представляет собой результат активности большого числа генов. Таким обра­зом, при анализе этой РНК выявился еще один парадокс: ядра эритроцитов в течение нескольких дней синтезируют высокомолекулярную полидисперсную РНК, представляю­щую собой продукт деятельности многих генов, и в то же время в них не происходит синтез видоспецифичных бел­ков; но когда в ядрах эритроцитов начинается образование рибосомной РНК (28S- и 16S-PHK), появляются и специ­фичные для этих ядер белки.

По-видимому, имеется три возможных варианта для объяснения этих наблюдений. Например, что полидисперс­ная РНК, которая образуется в ядрах эритроцитов до раз­вития ядрышек, не содержит инструкций для синтеза бел­ка. Такое объяснение кажется неприемлемым, поскольку влечет за собой неправдоподобный вывод, что гены, опре­деляющие синтез белков, все это время не транскрибиру­ются, а затем в какой-то момент после появления ядрышка вдруг начинается их транскрипция. Более того, если поли­дисперсная РНК не содержит хоть сколько-нибудь моле­кул с инструкциями для синтеза белков, то ее функции непонятны, особенно если учесть, что эта РНК, по-види­мому, представляет собой единственный продукт деятель­ности большой группы генов. Можно также предположить, что полидисперсная РНК содержит инструкции для синтеза белков, но не способна программировать уже сущест­вующие рибосомы гетерокариона. Поскольку в гетерока­рион почти не попадает цитоплазма эритроцита (тем более, что зрелые эритроциты фактически не содержат рибосом), и все исходно присутствовавшие в гетерокарионе рибосомы представлены рибосомами клеток мыши или человека, нельзя было исключить возможность того, что РНК, образовавшаяся на куриных хромосомах, не способна программировать мышиные или человеческие рибосомы. Однако если гибридные клетки содержали небольшое ко­личество куриного генетического материала, то в таком случае куриные гены были способны определять синтез видоспецифичного фермента, несмотря на то что в этих гибридах не содержалось куриной рибосомной 28S-PHK (которую можно отличить от 28S-компонента мышиной ри­босомной РНК по электрофоретическим свойствам) [37,38]. Отсюда ясно, что синтезируемая на куриных генах РНК может транслироваться в мышиной цитоплазме. И наконец, возможно, что полидисперсная РНК содержит инструкции для синтеза белков, но перенос ее в цитоплазму осущест­вляется при участии ядрышка. Поэтому РНК, синтезиро­ванная до образования ядрышка, не может быть перенесе­на в цитоплазму и должна разрушаться внутри ядра.

Последнюю возможность проверили в опытах, где от­дельные ядра гетерокариона инактивировали микролучом ультрафиолетового света [29, 39]. Если ядра эритроцитов до образования ядрышек не способны выделять синтези­рованную ими РНК в цитоплазму, то в гетерокарионах с инактивированными ядрами из клеток мыши (или чело­века) такие «безъядрышковые» ядра эритроцитов не будут стимулировать включение метки в цитоплазматическую РНК при добавлении в среду меченых предшественников РНК. И наоборот, следует ожидать, что ядра эритроцитов начнут вносить свой вклад в цитоплазматическую РНК гетерокариона, а следовательно, способствовать включе­нию в нее метки сразу же после того, как в них образуют­ся ядрышки. Для исследования были выбраны гетерокари-оны, содержащие одно мышиное ядро и до четырех ядер куриных эритроцитов. Мышиные ядра инактивировали микролучом и затем гетерокарионы инкубировали с радио­активным предшественником РНК в течение различных сроков (время инкубации не превышало 6 ч), после чего определяли количество метки в цитоплазматической РНК. Поскольку после облучения ядра даже в одноядерных клет­ках метка продолжает включаться в цитоплазматическую РНК (хотя и в очень незначительном количестве), контролем в опытах служили одноядерные клетки мыши из этих же самых культур, у которых также облучали ядро. Изме­рения производили в разные сроки после слияния клеток: когда еще ни в одном ядре эритроцита не образовались ядрышки, когда они начинали появляться в части ядер и, наконец, спустя много дней после того, как в подавляю­щем большинстве ядер эритроцитов возникали полноцен­ные ядрышки.

До тех пор пока в ядрах эритроцитов еще не появились ядрышки, количество включенной метки в цитоплазму гетерокарионов с инактивированным мышиным ядром не отличалось от такового в контрольных одноядерных мыши­ных клетках с облученными ядрами (фиг. 13). Это наблю­далось даже в гетерокарионах, содержавших по несколько реактивированных ядер эритроцитов, которые, судя по радиоавтографам, совместно синтезировали очень большие количества РНК. Таким образом, несмотря на то, что реактивированные ядра эритроцитов еще до образования ядры­шек синтезируют очень много РНК, они не способны выводить хоть сколько-нибудь заметные количества ее в цитоплазму. Опыты, проведенные на стадии, когда в неко­торых ядрах эритроцитов уже появились ядрышки, показа­ли, что уровень включения метки в цитоплазму таких гетерокарионов стал теперь заметно выше, чем в одноядер­ных клетках с облученными ядрами (фиг. 14); когда же ядрышки образовались в подавляющем большинстве ядер эритроцитов, в цитоплазме гетерокарионов уже обнаружи­валось значительно больше метки, чем в контрольных одноядерных клетках с инактивированным ядром (фиг. 15). На фотографиях XVI, В и XVII, А показано, как включа­ется метка в цитоплазматическую РНК необлученных ге­терокарионов, а также в РНК гетерокарионов, у которых ядро клетки мыши инактивировали еще до образования ядрышка в ядре эритроцита. Видно, что ядро эритроцита продолжает синтезировать РНК, но эта РНК не переходит в цитоплазму. На фотографии XVII, Б для сравнения пред­ставлен гетерокарион, в котором мышиное ядро инактиви­ровали уже после образования ядрышка в ядрах эритроци­тов. В этом случае появление метки в цитоплазме в зна­чительной степени обусловлено переходом в нее меченой РНК из ядра. Приведенные данные позволяют нам понять, почему ядра эритроцитов исходно не могут определять синтез специфичных белков: это невозможно до тех пор, пока в них не разовьются ядрышки; лишь после этого ядра приобретают способность передавать в цитоплазму генети­ческую информацию.

Соотношение числа зерен метки в ядре и цитоплазме гетерокарионов...

Соотношение числа зерен метки в ядре и цитоплазме гетерокарионов…

Опыт, подобный показанному на фиг. 13...

Опыт, подобный показанному на фиг. 13…

Опыт, аналогичный представленным на фиг. 13 и 14...

Опыт, аналогичный представленным на фиг. 13 и 14…

Радиоавтограф еще одного гетерокариона...

Радиоавтограф еще одного гетерокариона…

Конечно, сразу возникает вопрос, относится ли этот вывод только к ядрам эритроцитов, восстановившим ак­тивность в таких необычных условиях, или же и в нор­мальных одноядерных клетках ядрышко играет решающую роль в передаче генетической информации из ядра в цито­плазму. Метод инактивации ядрышка с помощью микро­луча ультрафиолетового света позволил получить прямые доказательства участия ядрышка в этом процессе. Для опытов были выбраны нормальные одноядерные клетки HeLa, поскольку многие из них содержат только одно хо­рошо развитое ядрышко, которое легко инактивировать микролучом. Включение метки в ядерную и цитоплазма­тическую РНК сравнивали в следующих четырех группах клеток, взятых из одной и той же культуры: 1) необлучен­ные клетки; 2) клетки с одним ядрышком, облученным ультрафиолетовым светом в дозе, снижающей способность к синтезу РНК до 5% нормы; 3) клетки, в которых микро­лучом в той же дозе облучали внеядрышковую часть ядра (нуклеоплазму); 4) клетки, в которых более широ­ким микролучом облучали целиком все ядро.

Как и в предыдущих опытах, клетки после облучения инкубировали с радиоактивным предшественником РНК в течение различного времени, но не свыше 6 ч, а затем методом радиоавтографии исследовали включение метки в РНК. Было обнаружено, что инактивация только одного ядрышка уменьшала количество меченой РНК в цитоплазме приблизительно на 90% независимо от того, сколько РНК продолжало синтезироваться в остальной части ядра (фиг. 16). Такой эффект не мог быть неспецифичным по­следствием радиации, так как при облучении одной лишь нуклеоплазмы включение метки в цитоплазматическую РНК не снижалось. Облучение всего ядра гораздо большей дозой ультрафиолетового света снижало включение метки в цитоплазматическую РНК примерно так же, как и облу­чение одного только ядрышка (фото XVIII). Результаты этих экспериментов показали, что в отсутствие функцио­нирующего ядрышка РНК, синтезированная остальной частью ядра, не переносится в заметных количествах в ци­топлазму.

Сравнение числа зерен метки в цитоплазме и во внеядрышковой зоне ядра...

Сравнение числа зерен метки в цитоплазме и во внеядрышковой зоне ядра…

Радиоавтограф нормальной клетки HeLa...

Радиоавтограф нормальной клетки HeLa…

Следовательно, включение метки в РНК одноядерных клеток, у которых инактивировано ядрышко, подтверждает выводы, полученные при изучении ядер эритроцитов, вос­становивших свою активность в гетерокарионе. Оба эти случая свидетельствуют об участии ядрышек в переносе не только той РНК, которая образовалась в самом ядрышке, но и РНК, которая синтезировалась в любом другом участ­ке ядра. Чувствительность метода не позволяет, конечно, утверждать, что ядрышко участвует в переносе всей высо­комолекулярной РНК из ядра в цитоплазму, но очевидно, что основная часть метки, включенной в РНК, находящую­ся вне ядрышка, не может быть перенесена в цитоплазму, если ядрышко искусственно инактивировано или еще не сформировалось. Поэтому кажется маловероятным, что РНК, синтезированная в ядрышке, и РНК, синтезирован­ная в других частях ядра, переносится в цитоплазму клет­ки независимо друг от друга. Приведенные данные убеди­тельно свидетельствуют о том, что транспорт обоих типов РНК координируется единым механизмом, локализован­ным в ядрышке или около него.

Эти опыты опровергают любую модель передачи инфор­мации из ядра в цитоплазму, в которой постулируется, что РНК, несущая информацию для синтеза белка, проникает из ядра в цитоплазму и там присоединяется к уже суще­ствующим рибосомам; они опровергают также любую мо­дель, в которой постулируется переход в ядро цитоплазматических рибосом для того, чтобы снять информационную РНК с генов или перенести ее в цитоплазму. Ядро куриного эритроцита в гетерокарионе не передает в цитоплазму сколько-нибудь заметных количеств РНК и не определяет синтез видоспецифичных белков до тех пор, пока не разо­вьется его собственное ядрышко и не начнется синтез его собственной 28S-PHK (а возможно, и рибосом). Готовые рибосомы, имеющиеся в цитоплазме гетерокариона, не мо­гут переносить генетическую информацию из «безъядрыш­кового» ядра эритроцита.

Этот факт очень важен для понимания механизмов реа­лизации генетической информации. Ее поток из ядра в цитоплазму клетки, по-видимому, обязательно сочетается с потоком рибосом; а поток рибосом в свою очередь непо­средственно зависит от активности ядрышка. Ядрышко можно рассматривать как центр некоего общего регуляторного механизма, управляющего потоком не только компо­нентов структурных РНК, какими бы они ни были, но и теми компонентами рибосомного комплекса, которые не­сут информацию для синтеза белка. Если, исходя из при­веденных выше данных, считать, что нет самостоятельного потока информации из ядра в цитоплазму, и если РНК, которая несет инструкции для синтеза белков, переносит­ся в цитоплазму вместе со структурными компонентами рибосомного комплекса, то из этого следует, что в обычных условиях информационная РНК должна обладать в цито­плазме такой же устойчивостью, как и компоненты рибо­сомного комплекса. Пытаться выявить РНК, несущую инструкции для белкового синтеза, по ее относительной нестабильности с этой точки зрения все равно, что пытать­ся поймать блуждающие огни. Более того, если генетиче­ская информация не может переходить в цитоплазму без сопутствующего потока рибосом, «репрограммирование» цитоплазмы должно сопровождаться сменой одного семей­ства «программированных» рибосом другим. Поэтому когда клеткам приходится синтезировать нечто совершен­но новое, следует ожидать не только увеличения потока рибосомной РНК из ядра, но и разрушения рибосомных РНК в цитоплазме. И это в точности соответствует тому, что происходит на самом деле [40, 41].

Поведение реактивированных в гетерокарионе ядер эритроцитов помогает нам понять казавшееся загадочным явление внутриядерного обмена РНК [16, 42—47]. Если для того чтобы попасть в цитоплазму, образовавшаяся на хромосомах РНК должна сначала быть «захвачена» неким зависящим от активности ядрышка механизмом, то стадией, ограничивающей процесс передачи информации, может оказаться не синтез этой информационной РНК, а ее «за­хват» ядрышковым механизмом. Если ядрышко играет роль регулятора, что, очевидно, соответствует действитель­ности, то механизм «захвата» должен быть чувствителен к влиянию окружающей среды, в результате чего при изме­нении условий этим механизмом может захватываться раз­ное количество РНК, синтезированной на хромосомах. Предположение о том, что внутриядерный обмен РНК — это всего лишь распад той РНК, которая не была захваче­на ядрышковым механизмом, кажется весьма привлека­тельным. Если это действительно так, то следует ожидать, что внутриядерные превращения РНК интенсивнее долж­ны происходить в ядрах с плохо развитым или повреж­денным ядрышком. Анализ разнообразного эксперимен­тального материала подтверждает это предположение [16, 29, 39, 48—53]. Но имеется одна трудность. Хотя полидис­персная РНК, по-видимому, представляет собой единствен­ный первичный продукт активности большого числа генов, обнаружить ее в цитоплазме не удается. Поскольку инфор­мация, по крайней мере от некоторых генов, все-таки до­стигает цитоплазмы, приходится предполагать, что РНК, несущая эту информацию, в процессе «захватывания» и выведения в цитоплазму подвергается каким-то вторич­ным структурным перестройкам, которые меняют ее седи-ментационные свойства. Но тогда как же нам выявить ее в цитоплазме? Мы располагаем данными, показывающими, что средняя длина молекул «полидисперсной» ядерной РНК очень близка к длине молекул 16S-PHK [54, 55], что она имеет примерно такой же нуклеотидный состав [56] и что при соответствующих условиях она осаждается в зоне 16 S [57]. Все это свидетельствует о том, что «полидисперс­ная» РНК, возможно, присутствует в цитоплазме в виде компонентов с коэффициентом седиментации 16 S. Но пока еще мы не можем говорить об этом с уверенностью, и, пре­жде чем принять или отвергнуть подобную точку зрения, приходится ждать результатов дальнейшего анализа рибо­нуклеиновых кислот, осаждающихся в зоне 16 S.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. HarrisН., Watkins J. F., Hybrid cells from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different spe­cies, Nature, Lond., 205, 640 (1965).
  2. Harris H.,Hybrid cells from mouse and man: a study in genetic regulation, Proc. R. Soc, S, 166, 358 (1966).
  3. Harris H.,Behaviour of differentiated nuclei in heterokaryons of animal cells from different species, Nature, Lond., 205, 640 (1965).
  4. Harris H., Watkins J.F., Ford C. E., Schoefl G. I., Arti­ficial heterokaryons of animal cells from different species, J. Cell. Sei., I, I (1966).
  5. Harris H., Watkins J.F., Campbell G. le M., Evans E. P., Ford С. E., Mitosis in hybrid cells derived from mouse and man, Nature, Lond., 207, 606 (1965).
  6. Harris H.,Cell fusion, p. 19, Clarendon Press, Oxford, 1970.
  7. Okada Y.,The fusion of Ehrlich’s tumor cells caused by H. V. J. virus in vitro, Biken’s J., I, 103 (1958).
  8. Schneeberger E. E., Harris H.An ultrastructural study of inter specific cell fusion induced by inactivated Sendai virus, J. Sei., I, 401 (1966).
  9. Johnson R.Т., Harris H., DNA synthesis and mitosis in fused cells. I. HeLa homokaryons, J. Cell. Sei., 5, 603 (1969).
  10. Johnson R.Т., Harris H., DNA synthesis and mitosis infused cells. II. HeLa-chick erythrocyte heterokaryons, J. Cell. Sei., 5, 625 (1969).
  11. Johnson R.Т., Harris H., DNA synthesis and mitosis in fused cells. III. HeLa-Ehrlich heterokaryons, J. Cell. Sei., 5, 625 (1969).
  12. Watkins J.F., Chen L., Immunization of mice against Ehrlich ascites tumour using a hamster/Ehrlich ascites tumour hybrid cell line, Nature, Lond., 223, 1018 (1969).
  13. Nabholz M., Miggiano Y., Bodmer W.,Genetic analysis using human-mouse somatic cell hybrids, Nature, Lond., 223, 358 (1969).
  14. Migeon B. R., Miller C. S.,Human-mouse somatic cell hyb­rids with single human chromosome (Group E): link with thy­midine kinase activity, Science, N. Y., 162, 1005 (1968).
  15. Schwartz A., Cook P. R., Harris H.,Correction of a genetic defect in a mammalian cell (1970).
  16. WattsJ. W., Harris H., Turnover of nucleic acids in a non-multiplying animal cell, Biochem. J., 72, 147 (1959).
  17. Gowans J. L., Knight E. J.,The route of re-circulation of lymphocytes in the rat, Proc. R. Soc, B, 159, 257 (1964).
  18. Gowans J. L., McGregor D. D., Cowen D. M., FordСЕ., Initiation of immune responses by small lymphocytes, Nature, Lond., 196, 651 (1962).
  19. Cameron I. L.,Prescott D. M., RNA and protein metabolism in the maturation of the nucleated chicken erythrocyte, Expl. Cell Res., 30, 609 (1963).
  20. Langhans Т., Ueber Riesenzellen mit wandständigen Kernen in Tuberkeln und die fibröse Form des Tuberkels, Virchows Arch, path. Anat. Physiol., 42, 382 (1868).
  21. Harris H.,The reactivation of the red cell nucleus, J. Cell Sei., 2, 23 (1967).
  22. Bolund L., Ringertz N. R., Harris H.,Changes in the cyto­chemical properties of erythrocyte nuclei reactivated by cell fusion, J. Cell Sei., 4, 71 (1969).
  23. Bolund L., Darzynkiewitz Z., Ringertz N. R.,Growth of hen erythrocyte nuclei undergoing reactivation in heterokaryons, Expl. Cell. Res., 56, 406 (1969).
  24. Ringertz N. R.,Personal communication.
  25. Ringertz N. R., Bolund L.,Activation of hen erythrocyte deo­xyribonucleoprotein, Expl. Cell. Res., 55, 205 (1969).
  26. MittwochU., Lele К. P., Webster W. S., Relationship of Barr bodies, nuclear size and deoxyribonucleic acid value in cultu­red human cells, Nature, Loud., 205, 477 (1965).
  27. Mittwoch U.,Barr bodies in relation to DNA values and nuclear size in cultured human cells, Cytogenetics, 6, 38 (1967).
  28. Mittwoch U.,Nuclear sizes in a human diploid/triploid cell culture, Nature, Lond., 219, 1074 (1968).
  29. Harris H., Sidebottom E., Grace D. M., Bramwell M. E.,The expression of genetic information: a study with hybrid animal cells, J. Cell. Sei., 4, 499 (1969).
  30. Watkins J.F., Grace D. M., Studies on the surface antigens of interspecific mammalian cell heterokaryons, J. Cell. Sei., 2, 193 (1967).
  31. EspmarkJ. H., Fagraeus A., Identification of th. species of origin of cells by mixed haemadsorption: a mixed antiglobulin reaction applied to monolayer cell cultures, J. Immun., 94, 530 (1965).
  32. Coombs R. R. A., Marks J., Bedford D.,Specific mixed agglu­tination: mixed erythrocyte-platelet antiglobulin reaction for the detection of platelet antibodies, Br. J. Haemat., 2, 84 (1956).
  33. Harris H., Cook P.Д., Synthesis of an enzyme determined by an erythrocyte nucleus in a hybrid cell, J. Cell. Sei., 5, 121 (1969).
  34. Littlefield J. W.,Three degrees of guanylic acid-inosinic acid pyrophosphorylase deficiency in mouse fibroblasts, Nature, Lond., 203, 1142 (1964).
  35. Cook P. R.,Species specificity of an enzyme determined by an erythrocyte nucleus in an interspecific hybrid cell, J. Cell. Sei. (1970). In press.
  36. Fisher H. W., Harris H.,The isolation of nuclei from animal cells in culture, Proc. R. Soc, B, 156, 521 (1962).
  37. SchwarzA., Cook P. R., Bramwell M. E., Harris H., In preparation.
  38. Bramwell M. E.,In preparation.
  39. Sidebottom E., Harris H.,The role of the nucleolus in the transfer of RNA from nucleus to cytoplasm, J. Cell. Sei., 5, 351 (1969).
  40. Tata J. R.,Hormonal control of metamorphosis, Ciba symposium on control processes in multicellular organisms, p. 131, Churchill, London (1970).
  41. Cocucci S. M., Sussman M.,RNA in cytoplasmic and nuclear fractions of cellular slime mold amoebae, J. molec. Biol., 45, 399 (1970).
  42. Harris H.,Turnover of nuclear and cytoplasmic ribonucleic acid in two types of animal cell, with some further observations on the nucleolus, Biochem. J., 73, 362 (1959).
  43. Harris H.,Watts J. W., The relationship between nuclear and cytoplasmic ribonucleic acid, Proc. R. Soc, B, 156,109(1962).
  44. Harris H., Fisher H. W., Rodgers A., SpencerТ., Watts J. W., An examination of the ribonucleic acids in the He­La cell with special reference to current theory about the trans­fer of information from nucleus to cytoplasm, Proc. R. Soc, B, 157, 177 (1963).
  45. Harris H.,The breakdown of RNA in the cell nucleaus, Proc. R. Soc, B, 158, 79 (1963).
  46. Harris H.,Nuclear ribonucleic acid, Prog. nucl. Acid Res., 2, 20, Academic Press, New York (1963).
  47. Harris H.,Breakdown of nuclear ribonucleic acid in the pre­sence of actinomycin D, Nature, Lond., 202, 1301 (1964).
  48. Edström J. E., Chromosomal RNA and other nuclear RNA fra­ctions, Role of the chromosomes in development (Ed. M. Locke), p. 137, Academic Press, New York (1965).
  49. Bruns G. P., Fischer S., Lowy B. A.,A study of the synthesis and interrelationships of ribonucleic acids in duck erythrocytes, Biochim. biophys. Acta, 95, 280 (1965).
  50. Attardi G., Parnas H., Hwang M., AttardiВ., Giant-size rapidly labelled nuclear RNA and cytoplasmic messenger RNA in immature duck erythrocytes, J. molec. Biol., 20, 145 (1966).
  51. Karasaki S.,The ultrastructure and RNA metabolism of nuc­leoli in early sea urchin embryos, Expl. Cell. Res., 52, 13 (1968).
  52. Kijma S., WiltF. H., Rate of nuclear ribonucleic acid turno­ver in sea urachin embryos, J. molec. Biol., 40, 235 (1969).
  53. Perry R. P.,Selective effects of actinomycin D on the intra-cellular distribution of RNA synthesis in tissue culture cells Expl. Cell. Res., 29, 400 (1963).
  54. TamaokiТ., Lane B. G., The chain termini and alkalistable di-nucleotide sequenses in rapidly labeled ribonucleates from L cells, Biochemistry, N. Y., 6, 3583 (1967).
  55. Riley W.Т., Polynucleotide chain lengths of rapidly labelled and ribosomal RNA of mammalian cells and E. coli, Nature, Lond. 222, 446 (1969).
  56. Bramwell M. E., Harris H.,The origin of the polydispersity in sedimentation patterns of rapidly labelled nuclear ribonucleic acid, Biochem. J., 103, 816 (1967).
  57. Bramwell M. E.,Intranuclear accumulation of RNA resemb­ling the smaller ribosomal RNA component, J. Cell. Sei., 6, 53 (1970).