Диференціювання

1. Определения

Когда экспериментатор начинает задумываться над тем, насколько правильно используются те или иные научные термины, и пытается дать им строгое определение, его кол­леги огорченно качают головой, считая, что дни этого уче-него как экспериментатора сочтены. Но я боюсь еще боль­ше увеличить путаницу, царящую в эмбриологической терминологии, если стану употреблять самые обычные термины, не рассмотрев предварительно, какой в них вкладывается смысл. Во всяком случае я должен уточнить границы применения тех терминов, которыми буду поль­зоваться в этой главе.

Дифференцировкой обычно называют процесс образо­вания специализированных клеток, тканей и органов во время развития организма из оплодотворенного яйца. Ча­ще всего этот термин употребляют, когда говорят о много­клеточных организмах, и, следовательно, под ним подра­зумевается процесс возникновения из одной клетки — яй­ца — многочисленных клеток-потомков, гетерогенность которых возрастает по мере развития организма. Но экви­валентные в биологическом смысле процессы наблюдаются и у некоторых одноклеточных. В этом случае морфологи­ческой и функциональной специализации подвергается только часть клетки и в конце концов образуются структу­ры, подобные тем, которые имеются у многоклеточных ор­ганизмов, но у последних они состоят из множества кле­ток. Поэтому я предлагаю называть дифференцировкой любой процесс специализации независимо от того, проис­ходит ли он в одноклеточных или многоклеточных орга­низмах. Хотя мы и употребляем термины «дифференциро­ванный», «недифференцированный» и «дедифференциро-ванный», тем не менее установить их точный эмпириче­ский смысл совсем не так просто. Если считать яйцо недифференцированной клеткой, то тогда можно сказать, что клетки становятся дифференцированными по мере того, как они приобретают признаки, отличающие их как от самого яйца, так и друг от друга. Однако, поскольку уже две дочерние клетки, образующиеся после первого деле­ния, отличаются от яйца, правда, всего лишь своими раз­мерами, началом клеточной дифференцировки принято считать другое — возникновение выраженной гетерогенно­сти у клеток-потомков. Конечно, это чистая условность. Само яйцо представляет собой продукт сложного процесса дифференцировки, протекающего в яичнике, и мы могли бы разработать иную терминологию, приняв за точку от­счета какую-то другую клетку. Но я буду придерживаться общепринятых представлений и считать недифференциро­ванными клетками такие производные яйца, которые еще не приобрели заметных отличий, а дифференцированны­ми — те, в которых они уже есть.

Определить понятие «дедифференцировка» еще труд­нее, и здесь еще больше неясностей. Конечно, дифференци­рованная клетка никогда не превратится в оплодотворенное яйцо или хотя бы в одно из его ранних производных, так что, если подходить строго, слово «дедифференцировка» бессмысленно. Но при определенных условиях дифферен­цированные клетки, обладающие одним или несколькими характерными признаками, могут их утратить и приобрес­ти новые. В некоторых случаях такое превращение напоми­нает процесс, обратный дифференцировке в том смысле, что клетка, уже достигшая уровня специализации, характерно­го для какого-то этапа дифференцировки, становится похо­жей (по крайней мере внешне) на тех своих предшествен­ников, у которых еще не было этих признаков.

Это вовсе не означает, что действительно произошел возврат к исходному клеточному типу: дело в том, что мы можем лишь наблюдать утрату некоторых, легко выявля­емых признаков и замену их другими, которые труднее заметить. Поэтому слово «дедифференцировка» я буду употреблять с осторожностью и только в тех случаях, когда нужно описать исчезновение какого-нибудь легко обнару­живаемого признака или признаков, не обязательно подра­зумевая под этим, что произошла реверсия всего процесса дифференцировки.

2. Изменения в ДНК

Исследователи, которые впервые занялись изучением дифференцировки, пришли к заключению, что процесс этот является результатом постепенных изменений в генетиче­ском материале клетки. На эту мысль их навело простое наблюдение, что некоторые признаки очень устойчивы и могут сохраняться в течение многих клеточных генераций. В какой-то мере такая точка зрения подтверждается тем, что дифференцировка некоторых клеток сопровождается очевидными изменениями морфологии ядра и хромосом. Более современная и точная формулировка этого предпо­ложения звучала бы приблизительно так: дифференциров­ка — это результат изменений нуклеотидной последова­тельности в ДНК. В случае одной особой формы дифференцировки — образования антител клетками лимфо­идного ряда — сейчас принято считать, что специфичность антител определяется какой-то формой соматической ва­риабельности в нуклеотидной последовательности ДНК этих клеток. Однако более общую теорию, согласно кото­рой дифференцировка в целом происходит за счет измене­ний ДНК, теперь почти никто не поддерживает.

Всем, конечно, известно, что многие растения можно размножать вегетативно черенками или отводками, взя­тыми из различных частей растения. Иногда даже очень небольшие фрагменты любой части растения способны ре­генерировать целый организм. Следовательно, в полностью дифференцированных тканях этих растений содержится по крайней мере несколько таких клеток, которые при оп­ределенных условиях могут давать начало потомкам, диф­ференцирующимся в самых разных направлениях с обра­зованием тканей, характерных для всего организма. Совсем недавно такая способность к регенерации была выявлена у небольших групп клеток [2—4] и даже у одиночных кле­ток [5—7], культивируемых in vitro. Эти небольшие груп­пы клеток или одиночные клетки, размножаясь, образуют каллус, из которого иногда возникает целое растение. В ряде опытов удавалось получать целые растения из оди­ночных клеток, причем эти клетки были дифференциро­ванными, т. е. обладали морфологическими признаками, типичными для той ткани, из которой их выделяли [5—6].

В отношении животных клеток мы не располагаем столь наглядными примерами, но и они приводят нас к та­кому же выводу. Если пересадить ядра из опухолевых клеток почки взрослой лягушки (карцинома Люке) в эну­клеированные яйца лягушки, то яйца будут развиваться до стадии активно питающегося головастика [8—10]; из­вестно также, что у лягушек ядра из клеток кишечного эпителия головастика способны обеспечивать развитие яиц так, что в результате образуются взрослые и даже способ­ные к размножению особи [11, 12]. Следовательно, вполне естественно заключить, что если дифференцировка пред­ставляет собой результат изменений в нуклеотидной после­довательности ДНК, то такие изменения обратимы. Однако известны только четыре типа нарушений последователь­ности нуклеотидов в ДНК — это делеции, вставки, замены нуклеотидов и их взаимные превращения in situ. Мы дол­жны, таким образом, допустить, что в процессе дифферен­цировки происходит направленное накопление таких изменений, а также что они полностью обратимы в тех слу­чаях, когда у дифференцированных клеток восстанавли­вается какой-либо вид активности, утраченный на ранних стадиях развития.

Все, что мы знаем об изменениях ДНК самых разных организмов, не дает никаких оснований верить в реаль­ность такого процесса. В свете современных знаний спо­собность ядер некоторых дифференцированных клеток обеспечивать развитие целого растения или животного следует считать убедительным доказательством того, что дифференцировка не связана с изменением последователь­ности нуклеотидов в ДНК.

3. Дифференцировка и регуляция

В принципе у нас остаются три другие возможности: во-первых, дифференцировка может происходить благода­ря неодновременной избирательной транскрипции тех или иных участков ДНК, так что разные матрицы синтезиру­ются в разное время; во-вторых, дифференцировка может осуществляться в результате избирательной и неодновре­менной трансляции разных матриц; и, наконец, в-третьих, дифференцировку могут обеспечивать оба эти механизма вместе. Последнее предположение сейчас вполне обосно­ванно, и я обсуждал его в гл. IV, когда говорил о регуля­ции синтеза белка; и хотя совершенно очевидно, что дифференцировка включает такую форму регуляции, возни­кают еще две проблемы, которых я пока не касался. Боль­шая часть работ последних лет по регуляции синтеза белка проводилась на таких системах, где сохранение любого из­менения в синтезе белка зависит от постоянного присут­ствия стимула, который это изменение вызвал. Например, какая-то определенная малая молекула может индуциро­вать синтез какого-то белка, но стоит удалить из среды эту молекулу, как синтез белка немедленно прекратится, и, наоборот, другая малая молекула способна подавлять син­тез какого-то белка, но, как только ее удаляют, синтез сразу же восстанавливается. Хотя совершенно ясно, что диффе­ренцировка включает в себя подобные изменения, она включает, кроме того, такие изменения, которые сохраня­ются в клетках после удаления вызвавших их стимулов. В некоторых случаях исходный стимул запускает сложную цепь реакций, конечный результат которых — синтез спе­цифичного белка — наблюдается через много часов или дней после исчезновения первичного стимула. Это явление эмбриологи называют детерминацией. Вторая характерная особенность дифференцировки состоит в том, что фенотипические изменения, вызванные в клетке определенным стимулом, сохраняются после его удаления во многих кле­точных генерациях, а в некоторых случаях могут сохра­няться неограниченно долго.

Мне бы хотелось привести некоторые примеры, иллюст­рирующие эти две характерные особенности дифференци­ровки. Если у одиннадцатидневного зародыша мыши изъять дорзальную область зачатка поджелудочной желе­зы, содержащую эпителий и мезенхиму, и затем культиви­ровать этот фрагмент in vitro на пористой мембране, то произойдет дифференцировка и образуется типичная же­лезистая ткань, обладающая всеми структурными и функ­циональными признаками поджелудочной железы. На вто­рой день после эксплантации в клетках эпителия можно наблюдать ультраструктурные изменения, указывающие на начало дифференцировки; к третьему дню амилазная активность эксплантатов превышает исходную примерно в 100 раз, а между четырнадцатым и пятнадцатым днем в клетках появляются типичные зимогеновые гранулы [13].

Если же перед эксплантацией из зачатка удалить ме­зенхиму, то оставшийся эпителий не способен дифферен­цироваться в железистую ткань. Но если в течение первых 48 ч после эксплантации сохранить контакт мезенхимы с эпителием или поместить ее в непосредственной близости от эпителия, то все последующие стадии дифференцировки эпителия проходят нормально даже в том случае, когда мезенхиму затем удаляют [13, 14]. Совершенно ясно, что мезенхима посылает стимул, необходимый для дифферен­цировки эпителия, и коль скоро цепь событий, сопровож­дающих дифференцировку, началась, она приходит к сво­ему завершению, даже если в дальнейшем этот первона­чальный стимул отсутствует.

Из мышечной ткани куриного зародыша можно приго­товить суспензию предшественников мышечных клеток (миобластов), которые растут на стекле и в конце концов образуют монослой. Сначала они напоминают фибробласты и не обладают поперечной исчерченностью; в них не про­текают также ферментативные реакции, характерные для мышечных клеток, не способны они и к сокращению. Клет­ки растут на стекле без морфологических изменений до тех пор, пока монослой не станет сплошным. На этой стадии соседние клетки сливаются и образуются многоядерные элементы. После этого в них возникает поперечная исчер­ченность, развивается характерная для мышц фермента­тивная активность, а также способность к энергичным со­кращениям [15, 16]. В данном случае первичный стимул для образования мышцы был получен в зародыше еще до эксплантации клеток, но дифференцировка не проявлялась в течение нескольких клеточных генераций до тех пор, пока для завершения ее не создались подходящие условия.

Вместе с тем часто наблюдают, что клетки, обладаю­щие определенными морфологическими или биохимически­ми признаками дифференцированного состояния, подвер­гаются «дедифференцировке», т. е. утрачивают эти приз­наки при выращивании в искусственных условиях. Много­численные наблюдения такого рода в свое время привели к предположению, что дифференцированное состояние не может сохраняться при длительном культивировании вне организма. Однако исследования последних лет показали, что по крайней мере в некоторых случаях неспособность дифференцированных клеток размножаться вне организма обусловлена теми селективными преимуществами, которые получает in vitro популяция слабо дифференцированных клеток, в результате чего такие клетки размножаются быстрее дифференцированных [17]. Были предприняты шаги, чтобы устранить это селективное «неравенство». В результате удалось выращивать клетки, полностью со­храняющие in vitro тканевые биохимические и морфоло­гические особенности в течение многих месяцев, а быть может, и неограниченно долго. Как правило, линии диф­ференцированных клеток, способных к неограниченному размножению без утраты дифференцированного состояния, получали только из дифференцированных опухолей [17—20]. Но недавно удалось получить культуры диплоид­ных клеток зародыша, сохраняющих дифференцированное состояние многие месяцы: это мышечные клетки, эпители­альные клетки, синтезирующие пигмент, и клетки, обра­зующие хрящ [21—23]. Таким образом ясно, что в прин­ципе высокодифференцированное состояние может сохра­няться в течение многих генераций не только в организме, где, как предполагается, клетки находятся под постоянным воздействием индуктивных стимулов, но и in vitro, где (по крайней мере, при обычных условиях культивирования) такие стимулы полностью исключены.

4. Генетическая активность и дифференцировка

Определив, таким образом, две главные особенности дифференцировки, я хотел бы обсудить те отрывочные све­дения, которые мы о них имеем, чтобы выяснить, можно ли на основе этих сведений сделать хоть какие-то выводы о механизмах, лежащих в основе дифференцировки. По-моему, наиболее четкие опыты по изучению этого процесса были поставлены на одноклеточных организмах: и, по­скольку самые убедительные результаты были получены на ацетабулярии, нам придется вернуться к этой гигант­ской одноклеточной водоросли (см. гл. I). Напомню, что у ацетабулярии в течение многих недель растет только стволик и лишь затем при благоприятных условиях происходит дифференцировка и образуется плодовое тело или зонтик, с помощью которого рассеиваются споры. Образование зонтика — это классический пример дифференцировки, когда в клетке происходят глубокие морфологические и биохимические сдвиги; этот процесс во всех отношениях сходен с образованием плодовых тел у родственных много­клеточных организмов. Я уже говорил, что рост стволика у ацетабулярии и полная дифференцировка видоспеци­фичного зонтика могут происходить спустя много времени после удаления клеточного ядра. Следовательно, мы впра­ве заключить, что у этого организма явно выраженная дифференцировка никак не может быть непосредственным результатом избирательной транскрипции генетического материала. Стволик растет в какое-то определенное время вовсе не потому, что в это время транскрибируются ответ­ственные за него гены; также и зонтик формируется в со­ответствующее для него время вовсе не потому, что в это же время начинают считываться гены, контролирующие его рост. Очевидно, гены, участвующие в образовании ство­лика и зонтика, считываются задолго до возникновения этих структур. Опыты по преждевременной индукции фор­мирования зонтика, о которых упоминалось ранее, пока­зали, что транскрипция генов, ответственных за его обра­зование, у отдельных видов ацетабулярии должна проис­ходить по крайней мере за 70 дней до того, как обычно образуется зонтик [24]; из опытов по накоплению и сохра­нению информации в цитоплазме клетки стало ясно, что матрицы для образования и стволика, и зонтика поступают в цитоплазму в течение большей части периода роста клет­ки [25]. Более того, формирование зонтика можно задер­жать на неопределенно долгий срок, выращивая клетки в условиях недостаточной освещенности. При этом стволик продолжает расти и становится гораздо длиннее, чем всег­да. При увеличении освещенности на таких необычно длинных стволиках могут образоваться зонтики, даже если из этих клеток предварительно удалили ядра [26]. Отсюда ясно, что у ацетабулярии акт видимой дифференцировки осуществляется в цитоплазме на подготовленных заранее матрицах и что для этого присутствие соответствующих генов не обязательно.

Как я уже отмечал, это относится не только к ацетабу­лярии. Большинство одноклеточных организмов, сохраня­ющих жизнеспособность некоторое время после энуклеа­ции, в какой-то степени способны к дифференцировке. Но когда дифференцировка протекает при участии множества клеток, удаление ядер из всех этих клеток, конечно, невоз­можно, поэтому у нас нет столь убедительных данных о многоклеточных организмах, какие были получены при изучении ацетабулярии и стентора [27]. Однако опыты, в которых не удалось подавить основные этапы дифферен­цировки с помощью высоких доз актиномицина D у коло­ниальных миксамеб [28], в клетках поджелудочной железы зародыша мыши [29, 30] и в клетках куриного зародыша, синтезирующих гемоглобин [31], убеждают нас, что и у многоклеточных организмов по крайней мере видимые ста­дии дифференцировки не нуждаются в сопутствующей активности генов.

Итак, мы снова возвращаемся к вопросу о том, как дей­ствуют цитоплазматические регуляторные механизмы и, главным образом, как ранние изменения цитоплазмы обес­печивают затем упорядоченную последовательность собы­тий. Намек на такого рода организацию мы находим в явлении «последовательной индукции» ферментов у бакте­рий [32]. В этом случае последовательный синтез фермен­тов, участвующих в одной цепи биохимических реакций, начинается после того, как индуцировано образование пер­вого фермента этой группы; и обычно считается, что ко­нечный продукт каждого фермента или какое-то родствен­ное ему вещество индуцирует синтез следующего фермен­та [33]. Хотя такое явление при дифференцировке не исключено, полную аналогию, однако, проводить в данном случае нельзя: индуцированный синтез группы фермен­тов в бактериальной клетке зависит от постоянного при­сутствия в среде исходного индуктора, тогда как диффе­ренцировка характеризуется все более увеличивающейся независимостью от исходного стимула. Более того, при дифференцировке возникают изменения в структуре клет­ки и происходит синтез ферментов, относящихся к самым разным группам. Структурные изменения часто оказыва­ются центральным звеном процесса, и в электронной мик­роскоп можно наблюдать перераспределение рибосом в цитоплазме или развитие упорядоченной системы мембран еще до появления видимых признаков дифференцировки [34, 35]. У бактерий только два процесса вполне подобны тому, что наблюдается при дифференцировке высших кле­ток, — это образование и прорастание спор. В гл. II отме­чено большое сходство процессов образования спор и их прорастания у бактерий с соответствующими процессами у эукариотов; кроме того, я привел данные, свидетельству­ющие о том, что эти процессы, коль скоро они начались, постепенно утрачивают зависимость от активности генов. Поэтому можно надеяться, что дальнейшее изучение спо­рообразования и прорастания спор у бактерий будет спо­собствовать развитию наших знаний о дифференцировке высших клеток, даже если сейчас нам кажется, что изуче­ние генетической регуляции у вегетативных форм бактери­альных клеток не имеет прямого отношения к этой про­блеме.

5. Координация в многоклеточном организме

При изучении дифференцировки у многоклеточных воз­никает совершенно особая проблема. И если, что вполне вероятно, основополагающий биохимический механизм любого типа дифференцировки может быть сходным у одноклеточных и у многоклеточных, то в последнем случае необходимо еще объяснить, как обеспечивается согласо­ванная деятельность множества отдельных клеток. Коопе­ративный эффект может возникать двумя путями: если один и тот же стимул действует одновременно и одинаково на каждую клетку в отдельности или если клетки, взаимо­действуя друг с другом, вместе вырабатывают общий от­вет на любой стимул. Конечно, второе предположение на­много вероятнее, и сейчас уже получены убедительные экспериментальные данные, показывающие, что взаимо­действие клеток — это не просто способ, позволяющий клеткам одинаково реагировать на какой-либо стимул, но во многих случаях необходимое условие для осуществле­ния самой дифференцировки. Например, как я уже расска­зывал, зачаток поджелудочной железы зародыша мыши, помещенный в искусственную среду, при определенных условиях может дифференцироваться в функционирую­щую ткань поджелудочной железы [13, 14]. Если такой зачаток разрезать на мелкие кусочки и культивировать их отдельно, то дифференцировки эпителия в ткань подже­лудочной железы не наблюдается. Если же эти кусочки вновь поместить так близко друг от друга, что они могут слиться в сплошную массу, то дифференцировка происхо­дит [13, 36]. Аналогичное явление описано для других ви­дов эпителия [37]. Понятно, что в таких случаях диффе­ренцировка не может осуществляться без совместной ак­тивности большого числа клеток и что одна клетка или небольшая группа клеток не в состоянии создать условия, необходимые для дифференцировки.

Работы Левенштейна и его сотрудников помогли в ка­кой-то степени выяснить вопрос о том, как может возник­нуть такая кооперация [38—41]. Эти исследователи, изме­ряя с помощью микроэлектродов мембранный потенциал отдельных клеток (разность потенциалов по обе стороны мембраны), обнаружили, что в самых разнообразных эпи­телиальных тканях электролиты свободно переходят из клетки в клетку. Подобное явление наблюдалось в эпите­лии слюнных желез и почечных канальцев двукрылых, в чувствительном эпителии ампулы Лоренцини пластиножа-берных рыб жв эпителии мочевого пузыря жабы, в коже личинок хвостатых амфибий и в нормальной и регенери­рующей паренхиме печени крысы. Межклеточный обмен электролитами происходит через специальные области контакта тесно прилегающих мембран соседних клеток. Эти области известны под названием «мостиков» или плот­ных контактов (tight junction), и по данным электронной микроскопии в разных тканях их структура неодинакова. Более того, оказалось, что в зонах контакта может проис­ходить обмен не только ионами, но и более крупными моле­кулами красителя, и, по-видимому, даже макромолекула­ми, величина которых соответствует размерам молекул белков и нуклеиновых кислот [42]. Следовательно, все эти эпителиальные ткани можно рассматривать как единые функциональные системы; и вполне вероятно, что строгая локальность каждой последующей стадии в процессе диф­ференцировки многоклеточных организмов определяется именно тем, насколько развита какая-либо конкретная система межклеточных связей. Это предположение под­тверждают недавние работы по исследованию контактов между клетками в развивающихся зародышах [43—45].

6. Стимулы, вызывающие дифференцировку

Допущение, что яйцо — это недифференцированная клетка, имеет существенный недостаток: оно ведет к недо­оценке структурной и функциональной сложности самого яйца. Привычка считать яйцо недифференцированной клет­кой невольно приводит к представлению, что постепенно увеличивающееся разнообразие в его потомках должно обеспечиваться сложной последовательностью высокоспе­цифичных сигналов, а значит, и сложной системой генети­ческих переключений. Действительно, некоторые оптими­стически настроенные молекулярные биологи считают даже, что для того, чтобы понять, как происходит дифференцировка, нужно узнать только, когда и какие именно гены активируются. По крайней мере в отношении ранних стадий дифференцировки эта идея кажется очень сомни­тельной: имеющиеся данные совсем не поддерживают представления о том, что система генетических переклю­чений играет решающую роль в наблюдаемой последова­тельности событий. Хотя мы располагаем еще сугубо пред­варительными данными, они тем не менее дают основания считать, что у самых разных организмов вся информация, необходимая для ранних стадий зародышевого развития, оказывается в цитоплазме яйца еще до оплодотворения. Понять, когда в развивающемся зародыше появляются но­вые генетические инструкции, можно с помощью единст­венного пока надежного теста — определения времени появления отцовских маркеров. Многие ферменты облада­ют видовой и даже штаммовой специфичностью, что можно обнаружить по их различной электрофоретической подвиж­ности, чувствительности к температуре или другим физи­ческим свойствам. Если сперматозоид и яйцо принадлежат видам, у которых данный фермент имеет какие-то разли­чия, то анализ свойств фермента, синтезируемого зиго­той, позволит установить, когда новая генетическая инфор­мация передается в цитоплазму и начинает в ней трансли­роваться. После того как это произойдет, в зиготе будет синтезироваться не только материнские, но и отцовские ферменты. Несмотря на то что число таких работ еще очень невелико, все они свидетельствуют о том, что отцовские ферменты появляются лишь на сравнительно поздних ста­диях зародышевого развития. В яйце морского ежа, по-ви­димому, все ферменты, участвующие в переваривании оболочки при выходе из нее зародыша, материнского проис­хождения [46]. У амфибий отцовские ферменты появляют­ся только после того, как у зародыша начинаются мышеч­ные сокращения и сердцебиение [47]; у межвидовых гиб­ридов рыб и птиц отцовские ферменты также появляются только на поздних стадиях зародышевого развития [48]. Несомненно, что когда разработают более чувствительные методы определения отцовских маркеров, их удастся вы­явить несколько раньше, но и сейчас уже кажется вполне очевидным, что развитие зародыша до сравнительно позд­них стадий происходит преимущественно на основе мате­ринской информации, т. е. информации, содержавшейся в цитоплазме яйца еще до образования гетерозиготного ядра. Очевидно, на этих стадиях дифференцировка достигается не путем включения транскрипции определенных струк­турных генов, а за счет включения программы, уже при­сутствующей в цитоплазме яйца.

Какого рода сигналы должны быть ответственны за инициацию той или иной программы, заложенной в цито­плазме? Очевидно, специфичность этих сигналов зависит от того, перед сколькими альтернативными программами оказывается клетка в каждый определенный промежуток времени. Если, например, яйцо или его ранние производ­ные способны к выбору самых разных путей развития, то и сигналы, управляющие ранними стадиями эмбриогенеза, должны обладать соответственно высокой специфичностью; но если яйцо (или его ранние производные) в какой-то определенный период времени оказывается перед ограни­ченным числом возможных программ, то для выбора одной из них достаточно самых простых сигналов с очень низкой специфичностью. По всей вероятности, в действительности число путей, которые клетки могут избрать на ранних ста­диях развития, очень невелико и ограничивается лишь воз­можностью превращения в эктодерму, энтодерму или ме­зодерму, и только после осуществления этой первичной дифференцировки клетки оказываются перед следующими альтернативными путями развития. Если это и в самом деле так, то следовало бы ожидать, что сигналы, управляю­щие ранними стадиями дифференцировки, должны иметь очень низкую специфичность; вполне возможно, что и на более поздних стадиях развития высокоспецифичные сиг­налы не обязательны, поскольку число альтернативных путей, перед которыми клетка оказывается в каждый опре­деленный период времени, совсем невелико. Чрезвычайно сложная дифференцировка может возникнуть под влияни­ем самых простых сигналов, как это хорошо видно на при­мере поведения эксплантатов, взятых у кишечнополостно­го Hydra viridis [49]. Эксплантаты, содержащие только два типа клеток, в соответствующей среде могут регенериро­вать с образованием целого организма. При исследовании процесса регенерации in vitro оказалось, что направление дифференцировки двух типов клеток определяется ионным составом среды: различный ионный состав среды опреде­ляет различные типы дифференцировки. В дифференци-ровке амфибий на ранних стадиях развития движение электролитов, по-видимому, также играет определенную роль. Наибольшие изменения внутриклеточной концентра­ции ионов натрия в развивающемся зародыше происходят тогда, когда в бластоцисте образуется полость; и эти пере­мены сопровождаются изменением метаболизма клеток [50]. Таким образом, возможно, что движение электроли­тов — это обычная форма сигнала, который инициирует события на ранних стадиях зародышевого развития. По ме­ре продолжения дифференцировки вступает в действие система сигналов, идущих от одной клетки к другой. При­меры такого типа связей мы видим даже при самых при­митивных формах дифференцировки многоклеточных. Например, в жизненном цикле некоторых слизевиков, име­ющих клеточное строение, есть стадия, на которой одиноч­ные амебоидные клетки объединяются и образуют много­клеточное плодовое тело. Эта агрегация начинается после того, как некоторые амебоидные клетки выделяют веще­ство, вызывающее хемотаксис. Недавно выяснили, что это циклический аденозинмонофосфат, который узнают окружающие клетки [51, 52]. У гидры нервные клетки, на­ходящиеся внутри ножки и на ее поверхности, выделяют способное к диффузии вещество, по-видимому какой-то пептид, влияющий на размножение и дифференцировку клеток во всех остальных частях животного [53, 54]. Я уже упоминал о веществах, выделяемых мезенхимой, от кото­рых зависит дифференцировка эпителия поджелудочной железы у зародыша мыши [13, 14]. Подобные явления, на­блюдавшиеся в других зародышевых и регенерирующих тканях, не раз описывались в литературе.

Насколько можно судить по имеющимся данным, дей­ствие всех этих сигналов состоит, очевидно, не во включе­нии транскрипции новой генетической программы, а в осу­ществлении программы, подготовленной заранее. В этом отношении развитие зародыша, вероятно, не имеет прин­ципиальных отличий от дифференцировки зонтика у ацета­булярии или образования плодового тела у Dictiostelium, Транскрипция генов, ответственных за определенное собы­тие в процессе дифференцировки, происходит, как прави­ло, задолго до возникновения сигналов, которые иницииру­ют это событие. Как я уже указывал, большинство генов, контролирующих начальные стадии зародышевого разви­тия, транскрибируется, очевидно, еще до оплодотворения яйца. Одни гены могут транскрибироваться постоянно, как это, по-видимому, происходит в случае генов, ответст­венных за образование стволика и зонтика у ацетабулярии [24, 25]; транскрипция других генов может прекращаться, когда происходит избирательная конденсация разных участков хроматина. О последовательности считывания ге­нов в процессе зародышевого развития нам в сущности ничего не известно.

7. Наследуемая дифференцировка

Вероятно, труднее всего объяснить ту особенность диф­ференцировки, что некоторые признаки, связанные с диф­ференцированным состоянием, наследуются клетками и могут, по-видимому, сохраняться неограниченно долго. Необходимо, однако, подчеркнуть, что наследуемость ни­как нельзя считать непременным свойством дифференци­рованного состояния. Некоторые формы дифференцировки несовместимы с размножением клеток и, следовательно, никогда не передаются следующим поколениям клеток. Например, начало синтеза гемоглобина инициирует после­довательность событий, которая приводит к полному пре­кращению синтеза всех других белков и нуклеиновых кислот, а у некоторых классов позвоночных даже к элими­нации ядра. В организме взрослых животных имеется не­сколько типов высокодифференцированных клеток, кото­рые, по-видимому, никогда не делятся и из них никогда не возникают опухоли. Вместе с тем большинство тканей, способных к регенерации, дает начало таким же тканям: например, при размножении клеток печени образуются также клетки печени. В то же время при гистологиче­ском исследовании опухолей часто замечают, что быст­ро растущие опухоли, и особенно образующиеся из них метастазы, утрачивают признаки исходной ткани. Сейчас еще не ясно, можно ли считать этот процесс дедифференцировкой в том смысле, который был определен ранее, или же это просто результат постоянного отбора наименее диф­ференцированных клеток из исходной, смешанной попу­ляции. Во всяком случае теперь не остается сомнений, что при размножении клеток некоторые признаки дифферен­цированного состояния утрачиваются быстро, тогда как другие сохраняются в течение долгого времени. Часто со­хранение дифференцированного состояния невозможно без организации клеток в ткани, т. е. без совместной деятель­ности большого числа клеток, о которой я уже говорил. Можно возразить, что в целостном организме сохранение дифференцированного состояния в нескольких поколениях клеток, даже когда эти клетки находятся в необычных ус­ловиях, обусловлено постоянным воздействием стимула, индуцирующего или поддерживающего это состояние в каждом клеточном поколении. Такое возражение мало обос­новано, однако формально оно заставляет ограничить об­суждение сохраняющегося в клеточных поколениях диф­ференцированного состояния только теми случаями, когда его обнаруживают при длительном размножении клеток in vitro. Хотя таких случаев еще очень немного, они тем не менее открывают подход к решению этой проблемы.

Я уже приводил доводы, отвергающие гипотезу о том, что дифференцировка возникает в результате изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Следовательно, нужно искать другой механизм дифференцировки, основанный не на самовоспроизведении ДНК, а на чем-то ином. Самое простое решение, уже не раз выдвигавшееся ранее, состоит в том, что некоторые матричные РНК способны реплицироваться в цитоплазме. Сейчас эта идея почти не встречает поддержки, но даже если бы оказалось, что она правильна, нам все равно пришлось бы объяснять, почему не все матрицы способны к самовоспроизведению и почему при определенных условиях реплицируются именно эти матрицы, а не какие-нибудь другие. Иными словами, нужно было бы объяснить, почему при одних условиях цитоплаз­ма находится в одном состоянии, а при других — в другом.

Мы столкнулись бы с этим вопросом, даже если бы приняли модель дифференцировки, основанную на изби­рательной транскрипции ДНК. Если предположить, что какое-то дифференцированное состояние возникает в ре­зультате транскрипции определенных генов, то для того, чтобы такое состояние сохранялось во мпогих клеточных поколениях, необходимо в свою очередь предположить, что транскрипция этих генов поддерживается постоянно; сле­довательно, должны постоянно сохраняться те факторы, которые выбирают для транскрипции ту или иную группу генов. Поэтому любая модель должна объяснить, каким образом набор подобных факторов, однажды возникших в клетке под влиянием внешнего стимула, может затем по­стоянно воспроизводиться. Возможно, что на этот вопрос нет однозначного ответа, т. е. что самовоспроизведение каждого набора факторов, или условий, происходит с по­мощью особого механизма и что имеется множество таких механизмов.

Мне хотелось бы рассмотреть три случая, когда такое явление наблюдается у одноклеточных. Как я уже говорил раньше, синтез ß-галактозидазы у Е. coli индуцируется субстратом этого фермента и некоторыми родственными ему веществами. Синтез фермента, раз начавшись, продол­жается затем с максимальной скоростью, но прекращается сразу же, как только снижается концентрация индуктора или его удаляют из среды. Обычно наряду с индукцией синтеза фермента индуцируется и система пермеаз в кле­точной мембране, которая поддерживает необходимую кон­центрацию индуктора внутри клетки. Когда синтез фер­мента и система пермеаз индуцируются одновременно, концентрация индуктора в среде может упасть ниже уровня, необходимого для инициации синтеза, но клетки тем не менее сохраняют индуцированное состояние и про­должают синтезировать фермент с максимальной ско­ростью в течение многих генераций [55]. Благодаря индук­ции пермеазной системы концентрация индуктора внутри клетки оказывается достаточной для того, чтобы обеспе­чить максимальную скорость синтеза фермента даже при очень низкой концентрации индуктора во внешней среде. Это пример устойчивого изменения цитоплазмы, включаю­щего синтез специфичного фермента, вызванного установ­лением нового состояния равновесия в уже имеющемся метаболическом пути.

Второй пример касается образования клеточной стенки у Bacillus subtilis. Если эти микроорганизмы обработать лизоцимом, их клеточные стенки растворяются и образу­ются протопласты, одетые одной только клеточной мембра­ной. В соответствующей среде такие протопласты можно культивировать сколь угодно долго (или, по крайней мере, очень долго) в виде L-форм, лишенных нормальной кле­точной стенки. Однако, когда L-формы переносят на твер­дую среду, содержащую твердый агар или желатину, по­давляющее их большинство превращается в обычные палочки с нормальной клеточной стенкой [56—58]. Утрата способности образовывать клеточную стенку, по-видимому, связана с исчезновением из цитоплазмы клеток характер­ных мембранных структур, так называемых мезосом, кото­рые, очевидно, играют существенную роль в образовании клеточной стенки [59—61]. Переход в L-форму и последую­щая реверсия не имеют отношения к тому, что принято называть генетическими изменениями.

Третий пример касается закономерностей образования поверхностных антигенов у Paramecium. На поверхности этих клеток обычно имеется множество антигенов, набор которых может меняться. У каждого штамма Paramecium при одних условиях имеется один набор антигенов, а при других — другой. Если организмы с данным набором анти­генов недолго инкубировать при повышенной температуре или же очень быстро обработать специфичной антисыво­роткой, то набор поверхностных антигенов может изме­ниться и потомки этих клеток, если их выращивать в тех же условиях, что и исходную культуру, будут сохранять новый набор антигенов [62]. Другими словами, высокая температура или антисыворотка вызывает такое изменение в цитоплазме, которое приводит к замещению одной груп­пы поверхностных антигенов другой, и это изменение пе­редается по наследству.

Таким образом, в нашем распоряжении есть три приме­ра наследуемых цитоплазматических изменений. Один из них — приобретение способности синтезировать фермент, другой — потеря способности образовывать определенную структуру, и третий — замена одного набора антигенов другим. Вполне вероятно, что конкретные механизмы, ле­жащие в основе каждого из этих процессов, могут оказать­ся разными и, мне кажется, есть основания считать, что и в других случаях, когда мы наблюдаем наследственность такого типа, в основе ее тоже лежат разные механизмы.

Такие самоподдерживающиеся состояния в однокле­точных организмах очень напоминают случаи, о которых я только что говорил, когда клетки животных сохраняют дифференцированное состояние в течение длительного и даже неопределенно долгого периода культивирования их in vitro [16—23]. О биохимических механизмах, устанавли­вающих и поддерживающих дифференцированное состоя­ние в клетках животных, у нас нет хоть сколько-нибудь точных сведений. К решению этой проблемы можно подой­ти, исследуя гибриды между дифференцированными в оп­ределенном направлении клетками и какими-либо другими клетками [63]. При размножении клеток in vitro в ряде генераций может сохраняться не только исходное диф­ференцированное состояние, но и способность к некоторым специфичным формам дифференцировки под влиянием соответствующего стимула (наследование детермина­ции). Например, клетки тератокарциномы семенников мыши могут долгое время расти in vitro без проявления специфичных морфологических признаков; но если эти клетки ввести в организм здорового животного, то из них образуется опухоль с характерными признаками терато­карциномы [19]. Наиболее серьезно наследование детерми­нации изучали на клетках имагинальных дисков личинок Drosophila [64]. В результате дифференцировки из этих структур в конце концов образуются ткани взрослого животного, однако дифференцировку дисков можно задержать на неопределенно долгий срок, поместив их в брюшко взрослой мухи. Их можно также длительное время пасси­ровать, многократно пересаживая от одной мухи к другой, причем все это время они не будут дифференцироваться. Но если клетки такого эксплантата опять пересадить в ли­чинку, то имагинальные диски начнут дифференцировать­ся, подчиняясь при этом всем закономерностям, свойствен­ным клеткам этого диска (т. е. дифференцируются именно в те ткани, которые обычно возникают из этого диска). В данном случае вся программа для специфичной формы дифференцировки сохраняется в каждой клетке экспланти­рованного диска неограниченно долго, и для того чтобы эта программа реализовалась, необходим соответствующий сигнал, поступающий из тканей личинки. Иногда в клетках реализуется необычная программа (явление, известное под названием трансдетерминации), но, однако, многочис­ленные опыты свидетельствуют о том, что число программ, которые могут осуществить клетки любого имагинального диска, очень ограниченно. Таким образом, наблюдения подтверждают, что дифференцированная клетка всегда находится перед несколькими взаимоисключающими воз­можностями и что сигналы, определяющие выбор того или другого пути дифференцировки, могут быть очень просты­ми даже для самых сложных программ развития.

8. Изменения ядра при дифференцировке

И наконец, мне хотелось бы остановиться на тех изме­нениях, которые претерпевают ядра во время дифферен­цировки. Эти изменения могут быть чисто морфологиче­скими, но они могут также состоять в частичном или пол­ном подавлении транскрипции ДНК. Я уже говорил, что эти ограничения транскрипции ДНК в высших клетках представляют собой довольно грубый регуляторный меха­низм, включающий в себя конденсацию больших участков генетического материала; и этот механизм, по крайней мере в некоторых случаях, связан с изменением размеров ядра. Теперь мне хочется подчеркнуть, что, с моей точки зрения, ограничение синтеза РНК в ядре клетки не причина диф­ференцировки, а ее следствие. По-моему, нельзя представить себе, как такие грубые механизмы, подавляющие одновременно активность тысяч генов или целых хромосом, а иногда даже целых наборов хромосом, могут обеспечивать те высокоупорядоченные, точные и тонкие цитоплазмати-ческие изменения, которые происходят при дифференци-ровке. И в то же время совсем нетрудно вообразить, как, например, накопление в клетке гемоглобина может при­вести к постепенной конденсации хроматина в ядре и та­ким образом ингибировать синтез РНК. Конечно, подавле­ние синтеза РНК в одной части ядра и продолжение синтеза в другой его части должно иметь какие-то фенотипические последствия. Прекращение потока матриц из одной части ядра обязательно изменит соотношение разных матриц в цитоплазме, что может привести к выпадению некоторых ее функций. Все это свидетельствует о непрерывном вза­имодействии ядра и цитоплазмы, и вовсе не соответствует модели, исходящей из существования огромного числа высокоспецифичных генетических переключателей, каж­дый из которых «включает» строго определенный этап дифференцировки. Все, что я знаю о поведении клеток, не дает никаких оснований считать, что такая модель соот­ветствует действительности. И если сегодня мы все еще очень далеки от понимания механизмов дифференцировки, то это, по-моему, объясняется тем, что мы слишком усерд­но изучаем ядро клетки и уделяем недостаточно внимания цитоплазме.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Antibodies: Cold Spring Harb.Symp.quant. Biol., 32 passim (1967).
2. Steward F. C, Mapes M. O., Smith J.,Growth and organized development of cultured cells. I. Growth and division of freely suspended cells, Am. J. Bot., 45, 693 (1958).
3. Steward F. C, Mapes M.0., Mears K., Growth and organi­zed development of cultured cells. II. Organization in cultures grown from freely suspended cells, Am. J. Bot., 45, 705 (1958).
4. StewardF. C, Growth and organized development of cultured cells. III. Interpretations of the growth from free cell to carrot plant, Am. J. Bot., 45, 709 (1958).
5. Vasil V.,Hildebrandt H. G., Differentiation of tobacco plants from single isolated cells in microcultures, Science, N. Y., 150, 889 (1965).
6. Joshi P. C, Ball E.,Growth of isolated palisade cells of Ara­chis hypogaea in vitro, Devi. Biol., 17, 308 (1968).
7. Reinert J.,Morphogenese in Gewebe- und Zellkulturen, Natur­wissenschaften, 55, 170 (1968).
8. King T. J., McKinnell R. G.,An attempt to determine the developmental potentialities of a cancer cell nucleus by means of transplantation, Cell physiology neoplasia, p. 591, University of Texas Press (1960).
9. McKinnell R. G.,Development of Rana pipiens eggs transpla­ted with Lucke tumor cells, Am. Zool., 2, 430 (1962).
10. McKinnell R. G., Deggins B. A., Labat D. D.,Transplan­tation of pluripotential nuclei from triploid frog tumors, Science, N. Y., 165, 394 (1969).
11. GardenJ. В., The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells feeding tadpoles, J. Embryol. exp. Morph., 10, 622 (1962).
12. Garden J.В., Uehlinger V., «Fertile» intestine nuclei, Nature, Lond., 210, 1240 (1966).
13. GrobsteinС., Cytodifferentiation and its controls, Science, N. Y., 143, 643 (1964).
14. Fell P. E.,Grobstein C, The influence of extra-epithelial factors on the growth of embryonic mouse pancreatic epithelium Expl. Cell. Res., 53, 301 (1968).
15. KönigsbergI. R., The differentiation of cross-striated myofib­rils in short-term cell structure, Expl. Cell. Res., 21, 414 (1960).
16. KönigsbergI. R., Some aspects of myogenesis in vitro, Circula­tion, 24, 447 (1961).
17. Yasumura Y., Tashjian A. H., Sato G. H.,Establishment of four functional, clonal strains of animal cells in culture, Science, N. Y., 154, 1186 (1966).
18. Moore G. E.,In vitro cultures of a pigmented hamster melanoma cell line, Expl. Cell. Res., 36, 422 (1964).
19. Stevens L. C,Embryonic potency of embryoid bodies derived from a transplantable resticular teratoma of the mouse, Devi. Biol., 2, 285 (1960).
20. RichardsonI. U., Tashjian A. H., Levine L., Establishment of a clonal strain of hepatoma cells which secrete albumin, J. Cell. Biol., 40, 236 (1969).
21. Cahn R. D., Cahn M.В., Heritability of cellular differentia­tion: clonal growth and expression of differentiation in retinal pigment cells in vitro, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 55, 106 (1966).
22. Coon H. G.,Clonal stability and phenotypic expression of chick cartilage cells in vitro, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 55, 66 (1966).
23. Yaffe D.,Retention of differentiation potentialities during pro-Longed cultivation of myogenic cells, Proc. natn. Acad. Sei. USA, 61, 477 (1968).
24. Werz G.,Determination and realization of morphogenesis in Acetabularia, Brookhaven Symp. Biol., No. 18, p. 185 (1965).
25. HämmerlingJ., Zetsche K., Zeitliche Steuerung der Formbil­dung von Acetabularia, Umschau, 15, 489 (1966).
26. Hämmerling J.,Nucleo-cytoplasmic interactions in Acetabula­ria and other cells, A. Rev. PL Physiol., 14, 65 (1963).
27. Tartar V.,The biology of Stentor, p. 297, Pergamon Press, Oxford, 1961.
28. Sussman M., Sussman R. R.,The regulatory program for UDP galactose polysaccharide transferase activity during slime mold cytodifferentiation: requirement for specific sinthesis of ribonuc-leic acid, Biochim. biophys. Acta, 108, 463 (1965).
29. Wessells N. K., Wilt W. H.,Action of actinomycin D on exo-crine pancreas cell differentiation, J. molec. Biol., 13, 767 (1965).
30. Rutter W.J., Wessells N. K., Grobstein С, Control of spe­cific synthesis in the developing pancreas, J. natn. Cancer Inst. Monogr., No. 13, p. 51 (1954).
31. WiltF. H., Regulation of the initiation of chick embryo hemo­globin synthesis, J. molec. Biol., 12, 331 (1965).
32. Stanier R. Y.,Enzymic adaptation in bacteria, A. Rev. Micro­biol., 5, 35 (1951).
33. Mandelstam J., Jacoby G. A.,Induction and multisensitive end-product repression in the enzymic pathway degrading man­delate in Pseudomonas fluorescens, Biochem. J., 94, 569 (1964).
34. KallmanF., Grobstein С, Fine structure of differentiating mouse pancreatic exocrine cells in transfilter culture, J. Cell. Biol., 28, 399 (1964).
35. Wessells N. K., Evans J.,Ultrastructural studies of early morphogenesis and cytodifferentiation in the embryonic mam­malian pancreas, Devi. Biol., 17, 413 (1968).
36. Wessels N. K., Cohen J. H.,Early pancreas organogenesis: mor­phogenesis, tissue interactions and mass effects, Devi. Biol., 15, 237 (1967).
37. Deuchar E. M.,Effect of cell number on the type and stability of differentiation in amphibian ectoderm, Expl. Cell. Res., 59, 341 (1970).
38. Loewenstein W. R., Kanno Y.,Studies on an epithelial (gland) cell junction. I. Modifications of surface mambrane permeability, J. Cell. Biol., 22, 565 (1964).
39. Loewenstein W. R., Socolar S. J., Higashino S., Kanno Y., Davidson N.,Intercellular communication: renal, urinary blad­der, sensory, and salivary gland cells, Science, N. Y., 149, 295 (1965).
40. Loewenstein W. R., Kanno Y.,Intercellular communication and tissue growth. I. Cancerous growth, J. Cell. Biol., 33, 225 (1967).
41. Loewenstein W. R.,Penn R. D., Intercellular communication and tissue growth. II. Tissue regeneration, J. Cell Biol., 33, 235 (1967).
42. Kanno Y., Loewenstein W. R.,Cell-to-cell passage of large mo­lecules, Nature, Lond., 212, 629 (1966).
43. Sheridan J. D.,Electrophysiological evidence for low-resistance intercellular junctions in the early chick embryo, J. Cell. Biol., 37, 650 (1968).
44. Ito S., Loewenstein W. R.,Ionic communication between early embryonic cells, Devi. Biol., 19, 228 (1969).
45. Loewenstein W. R.,Emergence of order tissues and organs, Devi. Biol. Suppl., 2, p. 151 (1968).
46. Barrett D., Angela G. M.,Maternal characteristics of hatching enzymes in hybrid sea urchin embryos, Exp. Cell. Res., 57, 159 (1969).
47. Wright D. A., Subtelny S.,Expression of genes controlling enzymes in diploid and androgenetic haploid hybrid frog embryos, J. Cell. Biol., 43, 160a (1969).
48. Ohno S.,The preferential activation of maternally derived alle­les in development of interspecific hybrids, Heterospecific genome interaction, Wistar Institute Simposium Monograph No. 9, p. 137, Wistar Institute Press, Philadelphia (1969).
49. Burnett A. L.,The acquisition, maintenance and lability of the differentiated state in Hydra. The stability of the differentiated state (Ed. H. Ursprung), p. 109, Springer-Verlag, Berlin, 1968.
50. KostellowА. В., Morrill G. A., Intracellular sodium ion con­centration changes in the early amphibian embryo and the influ­ence of nuclear metabolism, Expl. Cell Res., 50, 639 (1968).
51. BonnerJ. Т., Evidence for the formation of cell aggregates by chemotaxis in the development of the slime mould Dictyostelium discoideum, J. exp. Zool., 106, 1 (1947).
52. Koni/n R. M., Barkley D. S., Chang Y. Y.,Bonner J. Т., Cyclic AMP: a naturally occuring acrasin in the cellular slime moulds, Am. Nat., 102, 225 (1968).
53. Burnett A. L.,Diehl N., Diehl F., The nervous system of Hydra. II. Control of growth and regeneration by neurosecretory cells, J. exp. Zool., 157, 227 (1964).
54. Lesh G. E., Burnett A. L.,An analysis of the chemical cont­rol of polarized form in Hydra, J. exp. Zool., 163, 55 (1966).
55. Novick A.,Weiner M., Enzyme induction as an all-or-none phenomenon Proc. natn. Acad. Sei. USA, 43, 553 (1957).
56. Landman O. E.,Halle S., Enzymically and physically indu­ced inheritance changes in Bacillus subtilis, J. molec. Biol., 7, 721 (1963).
57. Miller I. L., Zsigray R. M., LandmanО. Е., The formation of protoplasts and quasi spheroplasts in normal and chloramphe­nicol-pretreated Bacillus subtilis, J. gen. Microbiol., 49, 513 (1967).
58. Tichy P., LandmanО. E., Transformation in quasi spherop­lasts of Bacillus subtilis, J. Bact., 97, 42 (1969).
59. Ryter A., LandmanО. E., Electron microscope study of the relationship between mesosome loss and the stable L state (or protoplast state) in Bacillus subtilis, J. Bact., 88, 457 (1964).
60. Landman 0. E., Ryter A., Frehel C,Gelatin-induced rever­sion of protoplasts of Bacillus subtilis to the bacillary form: elect­ronmicroscopic and physical study, J. Bact., 96, 2154 (1968).
61. MillerI. L., Wiebe W., Landman О. Е., Gelatininduced re­version of protoplasts of Bacillus subtilis to the bacillary form: photomicrographic study, J. Bact., 96, 2171 (1968).
62. Beale G. H.,The antigen system in Paramecium aurelia. Inter. Rev. Cytol., 6, I (1957).
63. Harris H.,Cell fusion, pp. 48—56, Clarendon Press, Oxford, 1970.
64. Gehring W.,The stability of the determined state in cultures of imaginal disks in Drosophila. The stability of the differentiated state (ed. H. Ursprung), p. 136, Springer-Verlag, Berlin, 1968.

• ← Злиття клітин