1 рік тому
Немає коментарів

Sorry, this entry is only available in
Російська
На жаль, цей запис доступний тільки на
Російська.
К сожалению, эта запись доступна только на
Російська.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

За недолгие 15 лет генная инженерия превратилась в один из самых мощных инструментов познания живой материи. Получив возможность работать с индиви­дуальными генами, молекулярные биологи и генетики открыли совершенно новые их свойства. Именно бла­годаря генной инженерии обнаружено экзон-интронное строение генов эукариот, открыты многие регуляторные элементы, управляющие работой генов, выяв­лены мигрирующие гены. Возникла новая область мо­лекулярной биологии — белковая инженерия: появи­лась возможность конструировать новые белки] Про­изошло это потому, что ученые могут иметь в своем распоряжении любой ген в индивидуальном состоянии и проводить изучение его структуры всеми доступны­ми им методами. До недавнего времени специалисты работали лишь с механической смесью многих тысяч генов, к тому же разорванных случайным образом. Как прочитать генетический текст. Первый вопрос, на который теперь можно получить ответ, — это пер­вичная структура (или последовательность чередова­ния нуклеотидных остатков) гена. Пятнадцать лет на­зад задача определения нуклеотидной последователь­ности сегмента ДНК длиной лишь в несколько десят­ков нуклеотидов (напомним, что средняя длина генов приближается к тысяче нуклеотидных остатков) не всегда была разрешимой. (Правда, с определением первичной структуры РНК дело обстояло лучше.)

Для РНК уже давно обнаружены ферменты — рибонуклеазы, которые расщепляли ее цепь специфи­чески, т. е. после определенных остатков нуклеотидов (или, проще, по определенным буквам записанного в ней генетического текста). Так, рибонуклеаза TI, выделяемая из низшего гриба — аспергиллуса, разре­зает любую РНК после остатков гуаниловой кислоты (т. е. после буквы G), а рибонуклеаза А из подже­лудочной железы млекопитающих расщепляет РНК после пиримидиновых нуклеотидов (т. е. после букв U и С). Поэтому молекулу РНК можно постепенно рас­щеплять на все более и более мелкие перекрывающиеся фрагменты (вспомните частичное расщепление ДНК при построении их рестрикционных карт) до тех пор, пока не получались короткие олигонуклеотиды, доступные для химического анализа.

Первыми были исследованы транспортные РНК — самые короткие из известных тогда РНК (они состоят из 70—80 нуклеотидных остатков). В середине 60-х го­дов в лабораториях Холли (США) и А. А. Баева (СССР) их сначала научились получать в индивидуальном сос­тоянии, а затем определили их нуклеотидную последо­вательность. Потребовалось еще 10 лет, чтобы опреде­лить нуклеотидную последовательность вирусной РНК длиной примерно в 3500 нуклеотидных остатков. Эта работа требовала огромного труда самых искусней­ших экспериментаторов.

Для ДНК ферментов, подобных специфическим ри­бонуклеазам, известно не было. Но с открытием рест­риктаз изучение нуклеотидной последовательности сдви­нулось с места. Теперь появилась возможность неко­торые из доступных индивидуальных ДНК (к ним от­носились ДНК мелких вирусов и бактериофагов) на­правленно разрезать на фрагменты, с этих фрагментов с помощью РНК-полимеразы получать комплементарные РНК-копии и наконец, определять нуклеотидную после­довательность этих РНК.

Однако метод определения первичной структуры, как его часто называют секвенирования (от английско­го слова — последовательность) оставался прежним, очень медленным и сложным. Число же клонированных генов и их фрагментов росло. Требовались принципи­ально новые методы, которые бы в сотни раз ускорили анализ последовательности ДНК. И такие методы были разработаны.

Рассмотрим два из них, наиболее совершенных и распространенных. Первый называют методом Максама — Гилберта, по имени его создателей известного американского ученого У. Гилберта и его сотрудника А. Максама. А. Максаму и У. Гилберту ничего не при­шлось изобретать заново. Они «лишь» довели до со­вершенства идеи и разработки, по частям заложенные в работах многих предшественников: советских ученых С. К. Василенко, Е. Д. Свердлова, А. Д. Мирзабекова, бельгийца В. Фирса, англичанина Ф. Сэнгера и неко­торых других. В чем суть этого метода?

Рестрикционный фрагмент двутяжевой ДНК длиной в несколько сот пар нуклеотидов метят радиоактив­ным фосфором по его 5′-концам. Делают это с помощью фермента полинуклеотид-киназы, который выделяют из клеток кишечной палочки, зараженной бактериофа­гом Т4. Этот фермент отщепляет фосфатную группу от молекулы АТФ и переносит ее на 5′-конец полинуклео-тида. Затем двуспиральную ДНК денатурируют и от­дельные цепи ДНК разделяют электрофорезом в геле. После разделения каждую из цепей отдельно вымывают из геля и в отдельности изучают.

Далее наступает самый важный момент анализа: надо расщепить ДНК избирательно, по каждому из че­тырех видов нуклеотидов, ее составляющих; причем сделать это следует так, чтобы в каждом случае каждая отдельная цепь ДНК расщепилась только один раз. На рисунке 32 показано, как эти требования выполня­ются на примере сравнительно короткой нуклеотидной последовательности ДНК. Заметим, что А. Максаму и Г. Гилберту не удалось найти условий избиратель­ного расщепления ДНК по А и по Т. Но это не является препятствием, так как существуют условия, когда ДНК расщепляется только по G и только по С.

В каждом случае то звено, по которому проводится расщепление цепи, предварительно химически видоиз­меняется (модифицируется). Эта модификация как раз и должна проходить так, чтобы в каждом случае ви­доизменялась в среднем одна из букв на одну молекулу ДНК.

Из рисунка 32 видно, что препарат ДНК, разделен­ный на четыре порции, дает четыре набора фрагмен­тов. Их фракционируют также электрофорезом в геле. На этот раз гель изготавливают из полиакриламида. Для этого в узкий промежуток между двумя стеклами заливают раствор акриламида вместе с некоторыми добавками. Полимеризуясь, акриламид образует длинные полимерные цепи, а добавки сшивают эти цепи в не­которых местах. В итоге получается полимерная сетка, которая набухает в воде и дает прозрачный бесцветный гель, напоминающий желе. Полимеризацию ведут в растворе электролита, содержащего денатурирующие агенты (обычно мочевину), которые не дают фрагмен­там ДНК слипаться во время электрофореза. Смесь фрагментов ДНК наносят на верхнюю часть геля (в специально изготовленные там лунки); гель соединяют с сосудами, где находятся электролит и электроды. Электрофорез проводят при высоком напряжении (1500—2000 В). Как и обычно, при электрофорезе в геле низкомолекулярные фрагменты движутся быстрее, чем более крупные. Электрофорез, который здесь при­меняется, настолько совершенен, что он позволяет раз­делить все фрагменты ДНК по их длине. Иными сло­вами, отделить, скажем, фрагмент длиной в 91 нуклео­тидный остаток от фрагментов длиной в 90 и 92 остат­ка. Это условие обязательное: без такой максимальной разрешающей способности определить последователь­ность ДНК нельзя. Кроме того, чем длиннее участок электрофореграммы, на котором в данном геле проис­ходит разделение фрагментов с точностью до одного нуклеотида, тем длиннее сегмент ДНК, последователь­ность которого может быть определена в одном опыте. Многое, конечно, и здесь зависит от искусства экспе­риментатора, но определение последовательности участ­ка ДНК длиной в 200—250 остатков в одном экспери­менте никого сейчас не удивляет.

Схема определения 13-членной нуклеотидной последовательности в 30-членном полинуклеотиде химическим методом Максама - Гилберта...

Схема определения 13-членной нуклеотидной последовательности в 30-членном полинуклеотиде химическим методом Максама – Гилберта…

Остается добавить, что, как и обычно, зоны фраг­ментов ДНК выявляют на электрофореграмме с по­мощью авторадиографии (на гель в темноте наклады­вается рентгеновская фотопленка, которая засвечива­ется только в тех местах, где есть радиоактивная метка). На фотопленке видны лишь те фрагменты ДНК, кото­рые помечены по 5′-концу, а расстояние, которое они прошли от верха геля, точно соответствует их длине. Теперь остается «прочитать» последовательность ДНК снизу вверх, каждый раз отыскивая ближайшую по го­ризонтам букву. Образец такой авторадиографии вы видите на рисунке.

Важно, что, просеквенировав вторую, комплемен­тарную цепь фрагмента ДНК, исследователь имеет возможность проверить данные, полученные для пер­вой цепи. Нужно лишь помнить, что G и Т в одной це­пи соответствуют С и А в другой.

Второй метод секвенирования ДНК разработал за­мечательный английский ученый Ф. Сэнгер. На научном языке этот метод называют методом «с обрывом цепи» или «дидезокси»-методом. Прежде чем перейти к сути этого метода, скажем несколько слов о его создателе.

В 50-е годы Ф. Сэнгер прославился работами по определению полной аминокислотной последователь­ности белка-гормона инсулина. Это был первый случай, когда удалось расшифровать полную первичную струк­туру белка, причем всю методику исследований разра­ботал сам Ф. Сэнгер. Пионерская работа Ф. Сэнгера, отмеченная Нобелевской премией по химии, породила целую серию расшифровок аминокислотных последо­вательностей белков.

В начале 1964 г. Ф. Сэнгер прочитал в Московском университете цикл лекций по структуре белков. Но свою последнюю лекцию он неожиданно для всех посвятил РНК, сообщив, что переключается на изучение нуклеи­новых кислот. После этого он революционизировал ме­тоды секвенирования РНК, и первичная структура ви­русной РНК, о которой мы упоминали, была опреде­лена его методом. Когда появилась возможность сек­венировать большие ДНК, Ф. Сэнгер переключился на эту проблему. Он, в частности, нашел те условия электрофореза в полиакриламидном геле, которые поз­воляют разделять фрагменты ДНК, отливающиеся на один нуклеотидный остаток (их применили в своем ме­тоде А. Максам и У. Гилберт). Вклад Ф. Сэнгера в изучение структуры ДНК был так велик, что ему при­судили вторую Нобелевскую премию по химии. До него только один исследователь — прославленная Мария Кюри была дважды удостоена этой высшей научной награды.

Многие детали методов Ф. Сэнгера и Максама — Гилберта сходны. Но есть и принципиальное отличие — секвенирование по Сэнгеру ведут с помощью ДНК-поли­меразы, т. е. с помощью фермента, который не расщеп­ляет, а синтезирует цепь ДНК. Этот принцип, несмот­ря на все последующие усовершенствования, до сих пор остался неизменным. В современном варианте, работая по методу Сэнгера, поступают следующим образом.

Сегмент ДНК, нуклеотидную последовательность которого собираются определить, встраивают в спе­циальный вектор, изготовленный из ДНК бактерио­фага М13. Здесь следует вернуться к знакомой вам технике получения рекомбинантных ДНК.

Бактериофаг М13 необычный: он содержит одно-цепочную кольцевую ДНК. Эта его особенность, как вы увидите дальше, и используется при секвенирова­нии ДНК. Когда фаговая ДНК попадает в клетку ки­шечной палочки, она превращается в обычную дву­тяжевую кольцевую ДНК, которая реплицируется по­добно другим фаговым или плазмидным ДНК. Зна­чит, геном фага М13 можно иметь как в однотяжевом, так и в двутяжевом виде.

Из двутяжевой ДНК фага М13 сконструировали се­рию замечательных векторов. В ту ее область, кото­рая не важна для репликации, встроили полилинкер с местами разрезания примерно десятком различных рестриктаз, а все остальные участки для тех же рест­риктаз из ДНК убрали (таким образом, в полилинкере эти участки уникальны). Рядом с полилинкером встрои­ли универсальную нуклеотидную последовательность из 17 нуклеотидных пар. В такой вектор после раз­резания его одной из рестриктаз встраивают фрагмент ДНК, полученный посредством той же рестриктазы. Заметьте, что встроенный фрагмент оказался рядом с универсальной 17-членной последовательностью. Та­кой рекомбинантной ДНК заражают (трансфецируют) клетку. Рекомбинантная ДНК размножается в клетке и, одеваясь фаговыми белками, превращается в фа­говые частицы. Однако в фаг попадает только одна из цепей, и, выделяя фаг, а затем фаговую ДНК, мы сразу получаем ее в однотяжевой форме.

Теперь можно непосредственно приступать к сек­венированию ДНК методом «обрыва цепи». Как мы говорили, в основе этого метода лежит ДНК-полиме­разная реакция. А для ДНК-полимеразы обязательно требуется затравка. Для этого и была вставлена ря­дом с секвенируемым фрагментом 17-членная последо­вательность. Она расположена справа от него, т. е. ближе к 3′-концу молекулы ДНК. Затравкой будет 17-членный олигонуклеотид, комплементарный этой по­следовательности.

Если олигонуклеотид-затравку связать с ДНК-матрицей, а затем добавить ДНК-полимеразу и дезокси­нуклеозидтрифосфаты, то получим полную ДНК-копию нужного фрагмента. Заметьте, что в ДНК-полимераз­ной реакции каждое последующее звено цепи присоеди­няется к гидроксильной группе на ее 3′-конце.

Идея Ф. Сэнгера заключалась в том, что вместе с нормальными дезоксинуклеозидтрифосфатами (dNTP) в реакционную смесь вводили дидезоксинуклеозидтри­фосфат (ddNTP). Посмотрите внимательно на рисунок: остаток рибозы в ddNTR лишен гидроксилов как при 2′-, так и при 3′-атомах углерода. Если такой ос­таток попадет на 3′-конец растущей цепи, то и ДНК-по­лимераза не сможет присоединить к нему следующее звено, и в этой точке рост цепи остановится. Можно так подобрать соотношение dNTP и ddNTP, что оста­новка роста цепи будет происходить в среднем один раз на каждую растущую цепь. И тогда, проведя ре­акции полимеризации для каждого из четырех нуклеотидов, получим по сути дела такие же фрагменты, что и в случае метода Максама — Гилберта. Читая электрофореграмму (вернее, ее радиоавтограф), пом­ните, что секвенируемый сегмент ДНК комплементарен синтезирующейся цепи (не забывайте переводить G в С, С в G и т. д., рис. 33).

Секвенирование ДНК термикаторным методом Сэнгера

Секвенирование ДНК термикаторным методом Сэнгера

Чтобы проиллюстрировать значение методов Мак­сама — Гилберта и Сэнгера для современной молеку­лярной биологии и генетики, приведем такие цифры. В 1965 г. была известна первичная структура двух тРНК (общей длиной около 150 нуклеотидных остатков); к 1975 г., когда техника секвенирования РНК, каза­лось бы, достигла совершенства, удалось узнать пер­вичную структуру более сотни различных РНК и фраг­ментов ДНК, общая длина которых составила око­ло 10 000 нуклеотидных остатков; к 1986 г. была оп­ределена полная первичная структура многих вирусных геномов и плазмид, множества генов и регуляторных районов ДНК, суммарная длина которых превысила 6 млн. остатков. Сейчас известна полная первичная структура ДНК некоторых митохондрий и хлоропластов (эти клеточные структуры имеют собственную ДНК), причем в последнем случае длина молекул ДНК превы­шает 150 тыс. нуклеотидных пар.

Лучшее доказательство могущества современной генетической инженерии — это то, что в настоящее время идет серьезное обсуждение проекта секвенирования всего генома человека: ДНК общей длиной в ЗХ109 пар нуклеотидов! Конечно, технику секвенирования ДНК для решения такой грандиозной задачи (которую мож­но сравнить только с космическими проектами) по­требуется усовершенствовать. Подсчитано, что самый опытный экспериментатор, занимаясь только секвенированием, может определить за год последовательность ДНК длиной в 100 000 пар нуклеотидов. Это значит, что для реализации проекта секвенирования всего че­ловеческого генома сейчас требуется 30 000 лет. Одна­ко ученые рассчитывают в ближайшие годы не менее чем в 100 раз увеличить скорость секвенирования ДНК. Уже появились первые модели приборов, которые мо­гут определять последовательность ДНК автоматически.

Огромная информация, получаемая генными инже­нерами о нуклеотидной последовательности ДНК и РНК, может храниться только в памяти мощных ЭВМ. И только на ЭВМ эту информацию можно обработать. Компьютер может найти в гене промоторный участок, выявить ту его часть, в которой закодирован белок, пользуясь генетическим кодом, написать аминокислот­ную последовательность белка. Вот почему определение структуры генов привело одновременно к расшифровке первичной структуры множества белков, в том числе и тех, которые содержатся в клетке в ничтожных ко­личествах и прямо изучены быть не могут. С помощью ЭВМ можно также сравнивать структуру разных генов, определять степень их схожести и на этой основе ре­шать вопросы эволюции биологических видов. Одним словом, компьютер для современного генетика становит­ся таким же необходимым прибором, как и аппарат для электрофореза.

Белковая инженерия. Техника рекомбинантных ДНК и расшифровка нуклеотидных последовательностей ге­нов позволили начать работу по конструированию но­вых белков, которых нет в природе. Такое конструи­рование преследует минимум две цели. Во-первых, оно позволяет понять, как работают те или иные белки. Во-вторых, с его помощью можно получать более со­вершенные белки (более активные, более стабильные и т. д.).

С одним примером получения нового белка — хи­меры фермента β-галактозидазы и гормона соматостатина — мы уже встречались. Химеры, как вы пом­ните, получают, сшивая гены разных белков друг с другом. Можно представить трудность создания белка со многими взаимодополняющими активностями, что-то вроде молекулярного комбайна.

Здесь, однако, сами сшиваемые гены остаются без изменений. Тем не менее мы располагаем теперь способами изменять любой нуклеотидный остаток в гене (т. е. проводить его направленный мутагенез). Такие замены в кодирующих участках генов, естественно, приводят к заменам одних аминокислот в белке на другие. Если та­кие замены делать по заранее разработанному плану, то в итоге можно получать белки с совершенно новы­ми свойствами.

Чтобы осуществить такие направленные замены, ген белка помещают в вектор, изготовленный из ДНК фага М13, точно так же, как и перед секвенированием его по методу Сэнгера. Затем к выбранному участку гена (в котором закодирован интересующий нас участок бел­ка) синтезируют олигонуклеотид длиной в 18—20 остат­ков (олигонуклеотид такой длины прочно свяжется по­том с геном). Этот олигонуклеотид комплементарен гену по всей длине, кроме той буквы, которую можно заме­нить. На рисунке он специально обозначен звездочкой. Этот олигонуклеотид используют как затравку для ДНК-полимеразы. При этом ДНК-матрицу с видоизменяемым геном используют в однотяжевой форме. ДНК-полимера­за синтезирует на матрице новую цепь. В итоге получа­ется двуспиральная ДНК с одним дефектом — после репликации получается ДНК как с исходным геном, так и с мутированным геном. Эти последние ДНК «вылавли­вают» из смеси, пользуясь тем же олигонуклеотидом как зондом (ход клонирования генов с помощью зондов мы подробно описали в предыдущей главе). Этот зонд будет лучше связываться с мутированным геном, чем с исход­ным, и можно найти такие условия, когда он будет вы­лавливать только рекомбинантные ДНК с мутированным геном. В результате экспрессии мутированного гена по­лучают видоизмененный белок с запланированными за­менами аминокислот (рис. 34).

Схема олигонуклеотид-направляемого мутагенеза гена...

Схема олигонуклеотид-направляемого мутагенеза гена…

Весь этот подход назвали олигонуклеотид-направляе­мый мутагенез генов. Создали его совсем недавно, но уже есть первые очень обнадеживающие результаты. Так, удалось сконструировать и получить фермент ами­ноацил-тРНК-синтетазу (тот самый, который специфи­чески связывает аминокислоту с тРНК; см. главу 2), бо­лее активный, чем клеточный фермент. Удалось по за­ранее разработанному плану превратить белок-репрессор, регулирующий активность одного гена, в регулятор экспрессии другого гена. Все это только первые успехи. А возможности конструирования белковой инженерии неограничены (отметьте, белковая инженерия здесь продолжение генной). Вы можете спросить: зачем это надо? Неужели в огромном запасе генов биосферы не найдется нужного гена, чтобы создавать искусственный? Оказывается, возможности биологической эволюции ограничены. Каждая мутация происходит с довольно низкой вероятностью (в среднем 10—5). Допустим, чтобы изменить белок в нужную сторону, в гене долж­ны произойти одновременно три мутации, каждая из которых организму невыгодна (ухудшает белок), а все вместе дают желаемый эффект. Идти путем накоп­ления мутаций нельзя: гены с одной или двумя замена­ми дают неэффективный белок, который может при­вести к смерти организма. А вероятность наступления сразу трех равна 10—5 • 10—5 • 10—5 = 10—15. Та­кие ничтожные вероятности в природе практически не реализуются, времени существования Земли на них просто не хватит. А искусственный, управляемый че­ловеком мутагенез обходит эту трудность.

Затруднение в другом. Как правило, мы не знаем, как изменятся свойства белка, если в нем изменить один аминокислотный остаток на другой. Можно пред­сказать, например, что замена в гемоглобине в опреде­ленном положении глутаминовой кислоты на валин бу­дет ухудшать растворимость белка, и мутантный гемо­глобин, легко выпадающий в осадок, будет работать ху­же. А то, что такой гемоглобин (серповидноклеточный гемоглобин S) окажется ядовитым для малярийного плазмодия и что человек-мутант по этому гену не бу­дет болеть малярией, ни один химик-белковик предска­зать не сможет. Или лучше сказать, пока не сможет.

Химический синтез генов. Для решения многих задач генной и белковой инженерии требуются синтетические олигонуклеотиды, будь то полилинкеры для сшивания генов, зонды для «вылавливания» генов при их клониро­вании или затравки с дефектами при направленном му­тагенезе. Здесь мы хотели бы рассказать о том, как про­водится синтез таких олигонуклеотидов, что может сде­лать сейчас химик-синтетик в области создания генети­ческого материала.

С точки зрения органической химии не только олиго-нуклеотид, но и мононуклеотид — сложные соединения. В него входят компоненты, относящиеся к различным классам органических (гетероцикл, остаток сахара) и неорганических (остаток фосфорной кислоты) соедине­ний. Нуклеотиды содержат множество различных по свойствам функциональных групп. Именно эти группы, столь необходимые для создания правильной макромолекулярной структуры нуклеиновых кислот, обеспечи­вающие комплементарность полинуклеотидных цепей, представляют наибольшую трудность при химическом синтезе олигонуклеотидов.

Задача такого синтеза, на первый взгляд, выглядит просто: нужно шаг за шагом (в том порядке, который задан нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида) связывать фосфатную группу одного нуклеотида с гидроксильной группой другого так, чтобы каждый раз образовывалась 3’—5′-фосфодиэфирная связь. Сам по себе остаток фосфорной кислоты с гидроксилом саха­ра реагировать не будет; как сказали бы химики, он не­достаточно реакционноспособен, его нужно дополни­тельно активировать. Это значит, что к фосфорной груп­пе нужно направленно (не затронув другие функ­циональные группы нуклеотида) присоединить активи­рующую группировку. Далее реакцию активированно­го фосфата нужно прицельно провести с «правильной» ОН-группой сахара. Но по свойствам эта группа так по­хожа на функциональные группировки в других частях мононуклеотида, что единственный выход — как-то вы­ключить эти группы из «игры». Приходится их защи­щать, т. е. навешивать на них защитные группировки, делая недоступными для реакций с активированной фос­фатной группой.

Сильно упрощенная схема такого синтеза приведена на рисунке. Понятно, как много операций должен совер­шить химик-органик, чтобы получить олигонуклеотид все­го из двух звеньев. Причем эти операции должны моно­тонно повторяться для присоединения каждого нового звена. К тому же в конце синтеза олигонуклеотид нужно освободить от всех защитных группировок. Возникла мысль: нельзя ли все эти операции автоматизировать?

Упорная многолетняя работа завершилась успехом. Автоматические синтезаторы олигонуклеотидов появи­лись во многих лабораториях. Прибор, созданный в на­шей стране в год сорокалетия Победы над фашизмом, получил название «Виктория-4». В этом названии зву­чат отзвуки победы, одержанной учеными над сложной научно-технической проблемой, а также имя одного из пионеров автоматического синтеза олигонуклеотидов В. К. Потапова. В. К. Потапов и 3. А. Шабарова одними из первых сумели разработать так называемый твердо­фазный синтез олигонуклеотидов. Он и положен в осно­ву работы автоматического синтезатора.

Главный элемент автоматического синтезатора олиго­нуклеотидов — небольшой реактор — трубочка, запол­ненная полимером, приготовленным в виде мелких шари­ков (зерен). С зернами полимера химически сшит первый нуклеотид, фосфатная группа которого активиро­вана. Таким образом, этот нуклеотид готов присоеди­нить к себе следующий. Работой автомата управляет не­большая ЭВМ (рис. 35). По ее сигналу в реактор вво­дят раствор второго нуклеотида со всеми необходимы­ми реагентами. В память ЭВМ заложена нуклеотидная последовательность синтезируемого олигонуклеотида. Поэтому она «знает», какой из четырех нуклеотидов от­править в реактор. Если, например, эта последователь­ность АСТТСС, то к полимерному носителю с пришитым к нему А первым будет направлен С. Произойдет обра­зование первого динуклеотида (АС). Далее по сигналу ЭВМ все ненужные реагенты отмываются, а фосфорная группа приводится в боевое состояние — активируется. В реактор вводится Т, и все начинается сначала.

Схема автоматического синтезатора олигонуклеотидов

Схема автоматического синтезатора олигонуклеотидов

Так шаг за шагом автомат синтезирует весь олигонуклеотид. Когда синтез закончен (в нашем случае пос­ле присоединения С), ЭВМ дает сигнал снять все защит­ные группировки (для этого в реактор подаются необхо­димые реагенты), а затем и снять сам олигонуклеотид с полимерного носителя (рис. 36). После дополнительной очистки олигонуклеотид готов к употреблению.

Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов

Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов

На автоматическом синтезаторе олигодезоксирибо­нуклеотид длиной в 15—20 звеньев можно получить за несколько часов, а еще не так давно химик-синтетик тра­тил на это годы работы. Как вы уже знаете, олигонуклео­тиды такой длины дают стабильные комплексы с компле­ментарными им участками ДНК и РНК; поэтому обыч­но их размеры устраивают генных инженеров. А если нужно синтезировать большой фрагмент гена или даже целый ген? И такие задачи сейчас выполнимы.

Первый синтетический ген получил знаменитый ин­дийский ученый Г. Корана, работающий в США. Г. Ко­рана — один из создателей современной химии нуклеи­новых кислот, автор многих способов синтеза олигонук­леотидов. Ген, синтезированный Г. Кораной и его со­трудниками, по нынешним меркам невелик — около 150 нуклеотидных пар. Это ген одной из тРНК. Таким образом, он должен содержать в себе всю последова­тельность предшественника этой тРНК (но, конечно, в виде дезоксирибонуклеотида), к которой спереди при­соединен промотор, а сзади — терминатор, т. е. сигналы начала и окончания транскрипции.

Эта работа была выполнена в конце 60 — начале 70-х годов, когда только зарождались современные спо­собы химического синтеза генов. Автоматические синте­заторы олигонуклеотидов еще не существовали; поэто­му первый ген мог быть синтезирован только усилиями многих ученых: в те годы лаборатория Г. Кораны была настоящим международным центром синтетической хи­мии нуклеиновых кислот (работали в нем и советские ученые).

Одним из главных достижений Г. Кораны было соз­дание блочного способа синтеза длинных полинуклео­тидных последовательностей. Суть его показана на ри­сунке 37. Мы специально привели уже знакомый вам ген гормона соматостатина. Как видите, здесь опять исполь­зуется принцип комплементарности нуклеиновых осно­ваний. Каждый блок синтезируется так, чтобы его левая половина была комплементарна одному олигонуклеоти­ду, а правая — другому. После сборки всего гена из блоков их сшивают ДНК-лигазой. На концах синтети­ческого гена обычно оставляют однотяжевые последо­вательности для встраивания его в вектор, разрезан­ный рестриктазами.

Сборка синтетического гена гормона соматостатина

Сборка синтетического гена гормона соматостатина

Блочный метод в сочетании с современными спосо­бами синтеза олигонуклеотидов позволил получить мно­гие гены, в том числе такие большие белки, как интер­фероны. Теперь химик-органик может создать наследст­венное вещество, что является замечательным доказа­тельством власти современной науки над геном!