1 рік тому
Немає коментарів

Sorry, this entry is only available in
Російська
На жаль, цей запис доступний тільки на
Російська.
К сожалению, эта запись доступна только на
Російська.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

Есть отрасль человеческой деятельности, в которую генная инженерия вторглась в самые первые годы сво­его существования, — это медицина.

Болезни и наследственность. Медицина сталкивает­ся с множеством неполадок в человеческом организме. Наиболее известны инфекционные заболевания, вызы­ваемые бактериями (чума, холера, дизентерия, тубер­кулез, дифтерия и др.) и вирусами (грипп, бешенство, оспа, корь, гепатит, полиомиелит и т. д.). Сюда попа­дают болезни, возбудители которых низшие эукариоты, т. е. грибки и простейшие (малярия, сонная болезнь, амебная дизентерия, стригущий лишай). Иногда счита­ют, что причина, вызывающая заболевание, внешняя — попадание в организм возбудителя, а наследственность здесь роли не играет.

Это далеко не так, вернее, совсем не так. Известно, что предрасположение к какой-либо болезни может варьировать у разных представителей рода человеческо­го, и это свойство наследственное. Наш замечательный этнограф и путешественник Н. Н. Миклухо-Маклай, страдавший в тропиках от тропической малярии, пора­жался тем, что коренные жители — папуасы — ею прак­тически не болеют. Мы теперь знаем причину этого: у аборигенов низких широт часто встречаются аномаль­ные гемоглобины, ядовитые для малярийного плазмо­дия. Следовательно, малярия, вернее способность болеть ею, — наследственная болезнь.

Вот другой пример. Вы знаете, что существуют че­тыре группы крови: I, II, III, IV (или О, А, В и АВ в со­временном обозначении). Оказалось, что люди с группой крови 0 (универсальные доноры) — первые жертвы в чумной эпидемии, носители группы А чаще заболевают гриппом, АВ наиболее устойчивы к оспе. Известно, что туберкулез вызывается внешним, фактором — палочкой Коха. Это так, но… Однояйцевые близнецы имеют оди­наковый генотип, и если один заболевает туберкулезом, то и другой тоже (в 87% случаев). А у генетически раз­нородных двуяйцевых близнецов, развивающихся из разных яйцеклеток, совпадение лишь в 25%. Муж может заразить жену (или наоборот) лишь в 7% случаев. Что же, туберкулез — наследственное или инфекционное за­болевание? Пожалуй, и то и другое. Палочка Коха мо­жет развиваться в организме человека, если он к этому наследственно предрасположен.

К инфекционным заболеваниям примыкают болезни, вызываемые однократным или хроническим воздействи­ем на организм какого-нибудь неблагоприятного внеш­него фактора. Это разнообразная категория: и лучевая болезнь, и силикоз (болезнь шахтеров), и наркомания. Их объединяет то, что причина болезни вне организма, в воздействии среды. Но они не заразны.

Наоборот, есть такие болезни, которые вызываются не действием неблагоприятного фактора, а отсутствием нужного для жизни фактора. Это разнообразные ави­таминозы: цинга, рахит, бери-бери и др. И здесь грани­ца между наследственными и ненаследственными забо­леваниями условна. Цинга — авитаминоз, возникаю­щий от нехватки в организме аскорбиновой кислоты (витамина С). У человека (и у всех обезьян, а также морских свинок) не работает ген фермента α-гулонолактоноксидазы, превращающего глюкозу в аскорбино­вую кислоту. С точки зрения собаки, мыши, крысы цин­га — наследственная болезнь, которой болеют все при­маты.

Все перечисленные заболевания медики относят к числу таких, которые «определяются средой, а не наслед­ственностью». Но существуют и такие болезни, кото­рые полностью наследуются от родителей. Обычно это генетические дефекты, мутации какого-либо гена, уна­следованные от обоих родителей. К ним же относят по­томки хромосом. Примерами могут быть серповидноклеточная анемия (мутантные гемоглобины не только за­щищают от малярии, но, к сожалению, в гомозиготном состоянии приводят к смерти в раннем возрасте); гемофилия, при которой кровь не свертывается (гемофилик может погибнуть от царапины), и многие другие (всего известно свыше трех тысяч наследственных болезней). Генетический механизм расшифрован только у 10% за­болеваний.

К какой категории отнести наиболее распространен­ные болезни, такие, как коронарная недостаточность, инфаркт, атеросклероз, инсульт, гипертония, диабет, на­конец, рак? К какой категории отнести эпилепсию, нерв­но-психические заболевания? Их не принято считать наследственными, кроме наследственного диабета, ко­торый проявляется уже в детском возрасте. И это ошиб­ка. Однояйцевые близнецы — точные генетические ко­пии друг друга — отличаются удивительным совпаде­нием (конкордантностью) в болезнях: если один из них заболевает шизофренией, то и другой в 69% случаев то­же. Конкордантность для эпилепсии у близнецов — 67%, для сахарного диабета — 65%. Дело в том, что наследственными медицина привыкла считать болезни с монофакторным наследованием, определяемые одним аллелем. Предрасположенность к инфаркту миокарда и гипертонии, нервно-психическим заболеваниям и раку также генетически определена (детерминирована), но определяется многими генами. Неудачное сочетание этих генов вызывает повышение предрасположенности, и до­статочно легкого толчка извне, чтобы болезнь возникла. Все вы, наверное, знаете о случаях, когда инфаркты и приступы гипертонии возникали от «нервов», от силь­ных нервных потрясений. Но «порог болезни» у разных людей разный.

Старые прививки и новые вакцины. Рассмотрим на ряде примеров, что может дать (и уже дает) генная инженерная медицина. Рассмотрим инфекционные за­болевания, вызываемые бактериями и вирусами. Ушли в прошлое мировые эпидемии (пандемии) чумы, холе­ры, оспы, от которых в средние века вымирали целые народы. Туберкулезный больной раньше редко мог на­деяться на исцеление. Сейчас туберкулез и дизентерия, малярия и даже сонная болезнь, вызывавшая в Афри­ке поголовную смертность, отступают.

Лечение и предупреждение инфекций до недавнего времени имели две основы — антибиотики и направлен­ное стимулирование защитных сил самого организма, выработка у него иммунитета.

О действии антибиотиков вы уже знаете. Рассмотрим проблемы иммунологии. Если бы люди не имели до рож­дения системы иммунного ответа, они умирали бы в ран­нем детстве от любой бактерии, как марсиане в книге Г. Уэллса «Борьба миров».

На деле любой чужеродный белок или полисахарид с молекулярной массой 10 000 и выше (такие полисаха­риды слагают оболочки бактерий) и некоторые другие вещества, попадая в организм позвоночного животно­го, вызывают иммунный ответ. Такие вещества называ­ют антигенами. В ответ на введение антигена организм начинает синтезировать сложные белки — иммуноглобу­лины (более привычное их название — антитела). Эти белки соединяются с молекулами антигенов и выводят их из организма. Синтезируются антитела иммунной сис­темой — клетками костного мозга, тимуса и лимфати­ческой системы. Существует несколько типов иммунных клеток — иммуноцитов. Одни из них — А-клетки — только «обрабатывают» антигены для того, чтобы их «узнавали» другие, в первую очередь Т-клетки, или Т-лимфоциты, размножающиеся в вилочковой желе­зе — тимусе (рис. 38). Различают еще В-лимфоциты — производные костного мозга. Они главные «герои» иммунного ответа и иммунологической памяти. Различа­ют еще К-клетки (от английского killer — убийца), ко­торые находят в организме опухолевые и зараженные вирусами клетки и растворяют их. К-клетки активиру­ются специальным белком — интерфероном.

Упрощенная схема работы системы иммунного ответа...

Упрощенная схема работы системы иммунного ответа…

Как только антиген выведен из организма, концентра­ция антител в крови быстро начинает снижаться до ми­нимума. Повторное введение антигена вызывает быстрый, «без раскачки», ответ. Концентрация антител стреми­тельно возрастает, организм борется с чужими молеку­лами и истребляет их. Создается впечатление, что орга­низм «помнит» старое введение антигена. Точнее, «пом­нят» его лимфоциты, приобретшие способность синтези­ровать соответствующий иммуноглобулин. Они долго мо­гут проживать в иммунной системе, и пока они живы, организм устойчив к данному антигену.

Эта «память» приводит к тому, что человек, перебо­левший один раз какой-либо болезнью, вторично ею не заболевает, или она проходит у него легко, без ослож­нений. Иммунная система — величайшее достижение эволюции. К сожалению, не на все болезни организм приобретает устойчивый иммунитет. Малярией и амеб­ной дизентерией, гриппом можно заражаться и болеть многократно. Эта система уязвима. С возрастом тимус рассасывается, и пожилые люди становятся более уяз­вимыми к инфекциям. Развивается она медленно, и по­тому грудные дети к инфекциям так же уязвимы, как и старики. Есть и вирусы, разрушающие иммунную систе­му, прежде всего приобретший печальную известность СПИД (синдром приобретенного иммунного дефицита, т. е. иммунной недостаточности).

Эта система «слепа» и считает антигеном и оболоч­ку бактерии, и пересаженную почку или сердце. В та­ких случаях приходится подавлять иммунный ответ. Медики возлагают большие надежды на вновь откры­тый антибиотик циклоспорин. К сожалению, циклоспо­рин подавляет отторжение не только пересаженного ор­гана, но и открывает организм для инфекций. И так дей­ствуют все подобные вещества — иммунодепрессанты.

Порой иммунная система атакует и организм ребен­ка, развивающегося в теле матери, и даже собственные белки организма. Это так называемая аутоаллергия. И тем не менее без этой системы жизнь была бы невоз­можна.

Активировать иммунную систему, не зная еще о ее существовании, впервые смог в 1798 г. английский ме­дик Э. Дженнер. В то время черная оспа была опасной болезнью, уродовавшей и часто убивавшей людей. Из­вестна была и сравнительно безобидная болезнь — ко­ровья оспа, вызывавшая язвочки на вымени у коров. Доярки часто заражались ею, и Дженнер подметил, что после этого они оказывались устойчивыми к черной оспе.

Э. Дженнер предложил через царапины на предплечье заражать людей коровьей оспой. После первичного им­мунного ответа человек оказывался неуязвимым к оспе человеческой, черной. Позже узнали, что аналогичную прививку на Востоке люди практиковали с незапамят­ных времен, но Э. Дженнер этого не знал и по праву пер­вооткрывателя назвал эту процедуру вакцинацией (в пе­реводе с латинского — окоровливание). Оспенные при­вивки быстро распространились по свету. Однако вак­цина Э. Дженнера считалась хотя и выдающимся, но все же частным достижением медицины. Ни один медик не догадывался распространить этот принцип на другие инфекции. Понадобился гений великого французского химика и микробиолога Луи Пастера, чтобы увидеть в прививках чудодейственное, общее для многих болез­ней средство. Л. Пастер понял, что введение в организм сильно ослабленных или убитых болезнетворных фак­торов сделает его устойчивым и к повторному зараже­нию живыми.

Теперь это понятно: даже у убитых бактерий или ви­русов сохранялись оболочечные антигены, стимулиро­вавшие размножение лимфоцитов, синтезирующих ан­титела к ним. На весь мир прославило Л. Пастера изо­бретение прививок против бешенства. А ведь Л. Пастер не знал еще о существовании мира вирусов.

Так как вирус бешенства развивается в организме очень медленно, как и большинство вирусов, поражаю­щих нервную систему, Л. Пастер предложил вакцини­ровать ослабленным вирусом людей, уже укушенных бешеным животным. Тогда антитела успевали возникнуть раньше и подавляли массовое размножение другого виру­са, уже убийственного.

Впоследствии этот метод получил дальнейшее раз­витие. Медики научились получать концентрированные антитела на соответствующие антигены (например, на дифтерийный токсин или змеиный яд) и вводить их в кровь человеку, заболевшему дифтерией или укушенно­му змеей. Так появились, например, противокоревые гам­маглобулины. Их получают из донорской крови.

Донорская кровь — дорогой и малодоступный источ­ник антител, поэтому многие из них сейчас получают из сыворотки крови животных. Начало этому положили в 1890 г. Э. фон Беринг и Т. Китасато, получив таким образом противостолбнячную сыворотку. Особенно удач­но использовать для этой цели лошадей: ведь у лошади без особого вреда для нее кровь можно брать литрами. Так были получены сыворотки против дифтерийного ток­сина и змеиного яда. В наше время к этому старому ме­тоду добавлены лишь тонкие методы выделения нуж­ных антител в чистом виде.

Итак, вакцинация предохраняет от болезни: в орга­низм вводится антиген, на который вырабатывается ан­титело. При введение сыворотки мы лечим заболевшего, связывая попавшие в его организм антигены соответ­ствующим антителом, заимствованным у другого чело­века или животного, перед тем переболевшего этой бо­лезнью или вакцинированного против нее.

Получение вакцин и иммуноглобулинов в медицине сейчас хорошо отлажено. Но генная инженерия внесла сюда свои революционные идеи.

Вакцина, вводимая в организм для выработки имму­нитета, может быть мертвой или живой, т. е. содержать убитый (но сохранивший антигенные свойства) или жи­вой, но ослабленный вирус. Живые вакцины считаются более эффективными. Недаром полученная в СССР жи­вая вакцина детского полиомиелита завоевала весь мир, вытеснив американскую мертвую вакцину Солка. Но жи­вые вакцины таят в себе опасность: ведь вирус в резуль­тате обратной мутации может перейти снова в актив­ную форму. Возникла идея: получить в больших количе­ствах чистый вирусный белок-антиген и вводить его в ор­ганизм. Без нуклеиновой кислоты вирус не размножа­ется, а мутировать чистый антиген, конечно, не может. Например, вирус бешенства содержит пять белков: боль­шую вирусную полимеразу, белок, образующий оболоч­ку вируса, — нуклеокапсид, матричные белки М1, и М2 и гликопротеин G. Антигенной активностью обладает гликопротеин G.

Такая же ситуация наблюдается и для многих дру­гих вирусов, вызывающих опасные болезни человека. Среди многих белков, образующих оболочку этих виру­сов, только один или два обладают антигенной актив­ностью. Следовательно, для иммунизации действитель­но не нужен целый вирус, можно обойтись отдельными белками — субъединицами вируса. Такие вакцины так теперь и называют — субъединичными. Генная инжене­рия открыла простой и дешевый способ получения субъ­единичных вакцин. Достаточно из генома вируса (если это РНК-содержащий вирус, то используют его ДНК-копию) вырезать ген белка с антигенной активностью, встроить его в вектор и размножить этот белок в бакте­риальной клетке. Производство такого белка в отличие от получения вируса не только дешево, но и безопас­но, а сама вакцина и безопасна, и не содержит ничего лишнего.

Субъединичные генноинженерные вакцины получе­ны сейчас для вируса бешенства (гликопротеин G), ви­русов гепатита А и ящура (так называемый белок VP1) и некоторых других. Хотя эти вакцины, несомненно, най­дут применение в медицине, они, как правило, менее эф­фективны, чем целый вирус.

Вот почему генные инженеры вспомнили о вирусе осповакцины (вирусе коровьей оспы). Этот вирус сделал огромное дело: оспа полностью ликвидирована на зем­ном шаре и многие годы оспу перестали прививать. Одна­ко во многих странах мира существует хорошо налажен­ное производство осповакцины. Поэтому были разрабо­таны методы введения в геном вируса осповакцины любого необходимого гена и получения живых осповакцин, несущих антигены многих вирусов (о том, как это де­лается, мы рассказали в главе 4). Более того, в одном геноме удается объединить антигены многих вирусов, например вирусов гриппа и бешенства или вирусов гер­песа и гепатита В. Вирус герпеса в латентном (неактив­ном) состоянии имеется в организме многих людей и час­то проявляется при простуде и переохлаждении, вызы­вая «лихорадку на губах». Но он бывает значительно более опасным, если переселяется на слизистую оболоч­ку глаз, к тому же считается потенциально канцероген­ным, способным вызвать рак. Еще более опасен вирус гепатита. Инфекционный гепатит (болезнь Боткина) час­то переходит в неизлечимый церроз, а то и рак печени. Антиген вируса гепатита В (так называемый Nbs Ag) уже получен, но вакцинация им обходится дорого. Гораздо более перспективна вакцинация вирусом коровь­ей оспы, в которой встроен ген Nbs Ag. Тогда антиген не надо выделять и очищать — он сам размножается в орга­низме, создавая активный иммунитет: ведь сыворотка крови вакцинированного содержит антитела и может быть применена для лечения гепатита.

Великое достижение современной иммунологии — гибридомы (рис. 39). Лимфоциты иммунной системы человека могут размножаться в культуре и синтезиро­вать тот иммуноглобулин, который они синтезировали в организме. Однако срок их жизни невелик. Разрабо­таны способы слияния лимфоцитов с хорошо размножа­ющимися в культуре раковыми клетками определенных штаммов. Продукт такого слияния — гибридома — на­следует от «родителей» способности неограниченно раз­множаться в культуре и синтезировать строго индивиду­альные антитела. Такие гибридомы — источники моно-клональных антител — разводятся биотехнологически­ми методами. Это один из нечастых примеров, когда в биотехнологии как источник продукта используют не быстрорастущие клетки микроорганизмов (бактерий и низших грибков вроде дрожжевых), а клетки млекопи­тающих. Моноклональные антитела гибридом сейчас ис­пользуются как очень чувствительное средство диагнос­тики. В сочетании с радиоактивными изотопами они поз­воляют выявить ничтожные количества антигенов. А чем раньше поставлен диагноз, тем больше шансов на быстрое излечение болезни. Гибридомы, вернее синте­зируемые ими моноклональные антитела, используются для ранней диагностики не только заразных болезней. Широко известна тяжелая болезнь сердца — инфаркт, при которой повреждается сердечная мышца. Сокра­тительный белок мышечных волокон — миозин — при этом выходит из клеток на поверхность сердца и стано­вится доступным для антител. В США исследователи, используя гибридомы, получили моноклональные анти­тела на миозин, меченные изотопом индия. Это гамма-излучатель; поэтому можно получить на экране счет­чика изображение поврежденной части сердца, которую «облепляют» молекулы антитела. Так появилась возмож­ность диагностировать инфаркт у человека с сердеч­ным приступом раньше и точнее, чем любым другим способом.

Получение гибридомы...

Получение гибридомы…

Моноклональные антитела на белки раковых опухо­лей, например рака прямой кишки и яичников, позво­ляют выявлять метастазы задолго до того, как они мо­гут быть обнаружены по привычным для врачей кли­ническими симптомам. Не удивительно, что слово «гибридома» не сходит сейчас с уст медиков, разрабатываю­щих новые способы лечения и диагностики болезней.

Моноклональные антитела гибридом по всей вероят­ности обещают революцию в пересадке органов (почек, сердца, кожи, в будущем, возможно, печени) от чело­века к человеку. Иммунная система «слепа» — она наки­дывается и на болезнетворную бактерию, и на переса­женный орган, что становится причиной его отторже­ния. Врачи разработали немало иммунодепрессантов, подавляющих отторжение. Беда в том, что все время, пока они вводятся пациенту, он беззащитен от любой инфекции. Только эмбрионы млекопитающих неспособ­ны к иммунному ответу (иначе они отторгали бы белки матери), и введенный им антиген считают «своим», даже когда у них полностью развивается система лимфоцитов. Вот если бы это явление, так называемую иммунологиче­скую толерантность, воспроизвести у взрослого челове­ка, которому предстоит пересадка органа!

Английским ученым Р. Бенджамену и X. Вальдманну из Кембриджа удалось это сделать пока на мышах. Ме­тодом гибридом они получили моноклональное антите­ло на разновидность лимфоцитов, называемых Т-хелперами. Именно они «узнают» в организме чужие белки и клетки и наводят на них другие лимфоциты и антите­ла, они же — мишень для вируса СПИД. У мышей с вве­денным антителом Т-хелперы на 12 дней исчезли из крови на 90%, и им можно было вводить любой антиген.

Через 12 дней численность Т-хелперов возрастала до нормы, но организм уже считал введенный антиген «сво­им», не отторгал его! Дальше уже можно было не при­бегать к средствам подавления иммуного ответа. Видимо, в будущем врачи вместе с пересадкой органа будут вво­дить больному антитело на Т-лимфоциты. После этого, конечно, недели две ему придется полежать в стериль­ном боксе, но это приходится делать и сейчас, после вве­дения циклоспорина. А вновь появившиеся в крови лим­фоциты пересаженного органа не заметят. Для них он «свой». В перспективе возможна пересадка человеку ор­гана от животного другого вида.

Малярия — изнуряющая болезнь, до сих пор отрав­ляющая жизнь большой части человечества, особенно в тропиках. Медики успешно лечат ее хинином и его про­изводными. К сожалению, возбудитель малярии — маля­рийный плазмодий, хозяином и переносчиком которого являются комары из рода Anopheles, успел образовать штаммы, устойчивые к хинину. Против таких форм маля­рии химическая терапия бессильна. Вот если бы найти противомалярийную вакцину!

Ясно, что антигеном этой вакцины должны быть бел­ки оболочки спорозоитов той стадии развития паразита, которая скапливается в слюнных железах комара и при укусе попадает в кровь человека. Но как получить их в достаточных количествах?

Американские исследователи из Национального ин­ститута аллергологии и инфекций пошли по такому пу­ти. Гены белка оболочки спорозоитов должны быть в составе генома и той формы паразита, которая разру­шает эритроциты человека. Ее уже научились наращи­вать in vitro («в стекле»). Нарастив достаточное коли­чество массы плазмодия, исследователи выделили из нее ДНК, а из той — ген, кодирующий белок с антиген­ными свойствами. Белок очень своеобразный: он состо­ит из 41 четверки (тетрапептидов) аминокислотных остатков, соединенных последовательно, причем 37 чет­верок одинаковы. Антигенную активность проявляет даже короткая последовательность — всего из 12 ами­нокислот. Клонировать ген такой последовательности (36 нуклеотидов) элементарно, легко и получить боль­шие количества антигена. Осталось лишь проверить эффективность такой вакцины. Возможно, когда эта книга попадет к вам в руки, последний этап работы бу­дет уже проделан: поступили сведения о первых успеш­ных опытах.

Гораздо более «твердым орешком» оказалась сон­ная болезнь. Ее возбудитель — жгутиковое простейшее трипаносома — переносится в Экваториальной Африке кровососущей мухой цеце. Химические препараты для ле­чения сонной болезни уже разработаны. Эффективен, в частности, этидий бромид, о котором мы писали в гла­ве 3. Однако ни вакцины, ни сыворотки против сонной болезни получить не удается, и сейчас стало ясно поче­му. Клеточная оболочка трипаносомы слагается из бел­ковых молекул, обладающих антигенными свойствами. Естественно, иммунная система больного синтезирует антитела, облепляющие паразитов, обитающих в крови. Но трипаносомы сбрасывают свои оболочечные антиге­ны вместе с налипшими молекулами иммуноглобулинов и синтезируют новые, но уже другие. Новое поколение трипаносом, появляющееся в крови больного каждую неделю, имеет уже другую антигенную систему, против которой нужно заново вырабатывать иммунитет. Всего трипаносома имеет более 100 оболочечных антигенов, 100 недель она может размножаться в крови, не боясь иммуноглобулинов. За этот срок из одной трипаносомы может получиться 2100 клеток — это цифра с 30 нулями. Ясно, что больной погибает раньше, если не применить химиотерапию.

Интерфероны и вирусы. До сих пор мы говорили о син­тезе антител — противобактериальных и противовирус­ных факторов, которые действуют строго специфично. Иммуноглобулин против кори не действует на вирус бе­шенства и наоборот. Но защитные системы наших орга­низмов в принципе могут синтезировать и факторы ши­рокого действия, блокирующие развитие многих виру­сов.

Примером может быть интерферон (точнее, интер­фероны). Давно подмечено, что клетки, зараженные од­ним вирусом, приобретают временный иммунитет к за­ражению другим вирусом. Это явление назвали интер­ференцией. Оказалось, что интерференция — сложный процесс, определяемый многими факторами, в том чис­ле синтезом в клетке специального белка — интерфе­рона.

Теперь известны три типа интерферонов, обозначаемые первыми буквами греческого алфавита — α, β, γ. Их соответственно называют лейкоцитарными, фибробластными и иммунными. Первые два образуются в клетках при заражении вирусами и каким-то образом подавляют их развитие. Третий, γ -интерферон может блокировать рост некоторых типов злокачественных опухолей. Син­тез интерферонов в организме стимулируется не только вирусами и опухолевыми клетками, но и токсинами неко­торых бактерий, например стафилококков.

Интерфероны, очевидно, мощное защитное средство организма. К сожалению, они не всесильны. У многих людей, в первую очередь детей и пожилых, синтез этих защитных белков недостаточен, а это открывает ворота инфекции. Поэтому их приходится вводить в кровь боль­ных с помощью инъекций. В аптеках бывают препараты α – и γ-интерферонов получаемых из донорской крови (β -интерферон вырабатывается клетками соединитель­ной ткани). Но всех обеспечить защитными белками та­ким путем невозможно. Слишком дорогой и дефицитный источник — человеческая кровь. Никакой другой заме­нить ее невозможно. Интерфероны видоспецифичны. Впрочем, как это ни странно, свиной интерферон по струк­туре похож на человеческий и в некоторых случаях мо­жет его заменить.

Второй источник, на этот раз фибробластного, β-интер­ферона, — клетки человеческой плаценты. При рожде­нии человека отторгается плацента — те оболочки, в ко­торых развивался зародыш в теле матери. Плацента слагается соединительной тканью. Выделенный из нее препарат с интерферонной активностью получил назва­ние плаферон; его выделили в Тбилиси и планируют внед­рение в производство. Отличные стимуляторы синтеза интерферона — синтетические полинуклеотиды, образу­ющие двойные спирали, например поли-G и поли-С. Их можно вводить в организм вместе с вакциной против вируса.

Однако самый многообещающий путь — получение генноинженерных интерферонов, для чего следует клони­ровать их гены в плазмидных векторах. К счастью, ин­терфероны не очень большие белки. Они состоят из од­ной полипептидной цепи длиной в 140—170 аминокислот­ных остатков. Кроме того, гены некоторых интерферо­нов просто устроены. Например, ген α-интерферона не со­держит интронов. К тому же α-интерферон — негликозилированный белок. Поэтому работы по клонированию генов интерферонов, проводившиеся как в нашей стра­не, так и в ряде зарубежных стран, очень быстро при­вели к замечательным результатам.

Расскажем об одной из таких работ. Она была выпол­нена в лаборатории Е. Д. Свердлова в Институте биоорга­нической химии АН СССР.

Клетки селезенки человека обрабатывали токсином стафилококка, чтобы активировать гены интерферона. Синтез в клетках начинался, естественно, с процесса транскрипции — синтеза мРНК. Далее из клеток выде­ляли суммарную мРНК, в которой матрица для синтеза интерферона составляла едва ли десятитысячную долю.

Затем в ход пускали обратную транскриптазу (ревертазу), способную на нити РНК синтезировать компле­ментарную ей ДНК (кДНК). Ее и встраивали в плазмиду кишечной палочки. Так получили тысячи клонов компле­ментарных ДНК, из которых требовалось отобрать нуж­ный.

Бактерии, содержащие клоны, высевали на чашки Петри с твердой питательной средой, и после нескольких часов роста они образовывали колонии. Затем на каж­дую поверхность среды накладывали нитроцеллюлозный фильтр. Часть бактерий прилипала к нему, сохраняя точное расположение колоний. Теперь, если обработать фильтр раствором щелочи, клетки разрушаются, а де­натурированная ДНК сорбируется на нитроцеллюлозе.

Дальнейшую работу сильно облегчило то обстоятель­ство, что последовательность гена γ-интерферона была уже известна. Поэтому было возможно синтезировать зонд — небольшой фрагмент этого гена — простым хими­ческим синтезом. Этот фрагмент синтезировали «горя­чим», т. е. сильнорадиоактивным. Оставалось выдержать фильтры в растворе меченого фрагмента: кДНК интер­ферона, содержащаяся в некоторых клонах, образовыва­ла двойные спирали с меченым фрагментом. Отмытые от лишней метки фильтры экспонировались на рентге­новской фотопленке, и везде, где имелась нужная ДНК, появлялось черное, засвеченное пятно. Зная, где распо­ложено пятно на фильтре, нетрудно найти нужную ко­лонию бактерий на агаре и размножить этот клон — размножить ген интерферона. На этом работа еще далеко не закончена. Следует помнить, что ген интерферона вырван из родного эукариотного генома и находится в чужом окружении бактериальной клетки. К счастью, в нем уже нет интронов, с которыми «не умеют» рабо­тать бактерии: ведь он синтезирован по мРНК, из ко­торой интроны удалены еще в клетке селезенки. Но зато к последовательности «зрелого» интерферона к нему присоединен фрагмент, в совокупности с которым он образует ген белка-предшественника. Только предше­ственник может выйти из клетки в плазму крови. При этом фрагмент отщепляется и белок становится актив­ным. Этой системы созревания в кишечной палочке нет. Поэтому она может синтезировать в лучшем случае лишь неактивный предшественник, а вернее всего, транскрип­ции не будет: регуляторные системы, включающие гены, у бактерий другие.

К счастью, теперь уже можно наращивать клониро­ванный ген и иметь дело не со следовыми количествами, а с целыми микрограммами (для генных инженеров такое количество считается большим).

Пришлось отщепить фрагмент, кодирующий сигналь­ный пептид предшественника рестриктазой Ava II, разрывающей последовательность

CAGGAC

GTC | CTG

Правда, при этом отщепляется и часть, кодирующая «зрелый» интерферон, именно последовательность цис-тир-цис-глу. Эту последовательность из 12 нуклеотидов пришлось синтезировать химическим путем и пришить к поврежденному гену лигазой. Заодно к началу доба­вили кодон ATG, кодирующий метионин. Ведь у бакте­рий начало синтеза идет с метионинового кодона, играю­щего роль «заглавной буквы». Затем ДНК-лигазой при­соединили элемент Р (бактериальный промотор) плюс ту коротенькую последовательность, по которой бакте­риальные рибосомы узнают мРНК и начинают трансля­цию.

В результате всех этих сверхтонких манипуляций получился ген с липкими концами, пригодный для встрой­ки в вектор. Результатом работы явился штамм кишеч­ной палочки, который синтезирует человеческий интер­ферон до 30% суммарного белка клетки. С учетом потерь при выделении и очистке 1 л донорской крови дает при­мерно 1 мкг интерферона, а 1 л бактериальной взвеси — в сотни раз больше! Это большая удача. Такая работа осуществлена в нашей стране и с геном α-интерферона. Его уже получают в заводских условиях под назва­нием реоферона. Рекомбинантные интерфероны сейчас проходят клинические испытания, и будем надеяться, ско­ро появятся в нужном количестве в аптеках.

Интерфероны, вероятно, принесут еще немало нового. Пока неизвестно, каким образом эти чудо-белки останав­ливают вирусную инфекцию. Выявлено, что они стиму­лируют в клетках синтез непонятных олигонуклеотидов из остатков аденина, но со связями не 3’—5′, как в обыч­ных нуклеиновых кислотах, а 2’—5′! Может быть, эти олигоаденилаты «сбивают с толку» вирусные ДНК и РНК, присоединяясь к ним и блокируя дальнейшую реп­ликацию вируса?

Интерфероны активны внутри вида (видоспецифичны). Оказалось, что человеческий интерферон подавляет рост вирусов многих растений: вируса табачной мозаики и других, и даже миковирусов шампиньонов! Сомни­тельно, однако, чтобы опрыскивание растений раство­ром интерферона, пусть даже рекомбинантного или сви­ного, было экономически выгодным. Но может быть, удастся встроить ген интерферона прямо в геном ра­стения? Или для защиты растений пригодятся эти зага­дочные олигоаденилаты? Их относительно легко син­тезировать химическими методами. Может быть, они найдут применение и в медицине? Мы об этом скоро узнаем.

Болезни, по-настоящему наследственные. Теперь пе­рейдем к тем болезням, которые полностью, как пола­гают медики, определяются наследственностью.

Практически неизлечимы в наше время случаи, свя­занные с «поломками» хромосомного аппарата, потерей одной из хромосом в наборе (нуллисомики) или приобре­тением лишней (трисомики). Носители таких хромосом­ных мутаций нежизнеспособны или не оставляют потом­ства, поэтому эти мутации не накапливаются в популя­циях.

Иное дело — генные мутации, затрагивающие после­довательность нуклеотидов в гене. В результате возни­кает новый аллель, продуцирующий белок с изменен­ными свойствами.

Разные мутации приводят к возникновению различ­ных аллельных форм белков. Большинство из них аномальны: фермент плохо ускоряет реакцию, гемоглобин хуже переносит кислород, регуляторный белок хуже вы­полняет свои функции. Однако сразу проявляются в фе­нотипе только доминантные мутации. Большинство же мутации рецессивно, а так как мы получаем от отца и матери не меньше двух одинаковых генов, они могут на­капливаться в популяциях, передаваясь в скрытом виде.

Лишь когда в результате перемешивания генов в популяции человек получает и от отца, и от матери оди­наково измененные гены, действие их сказывается на раз­витии фенотипа. Так возникают наследственные болез­ни. У них своя специфика. Они не принимают харак­тера эпидемий, ими заболевают в единичных случаях. Но в государственном масштабе вред, наносимый ими, ве­лик. В США, например, свыше 20 млн. человек (каждый десятый!) страдают унаследованными от родителей рас­стройствами здоровья.

Следует сказать, что некоторые наследственные бо­лезни таковыми не считаются. Так, способность или неспособность чувствовать вкус органического соеди­нения — фенилтиомочевины — долгое время считалась безобидной, нейтральной генетической вариацией. Те­перь установлено, что у людей, которым фенилтиомо­чевина кажется безвкусной, чаще наблюдаются случаи зоба и кретинизма.

Первые попытки излечить наследственный дефект от­носились к важному гормону, управляющему углевод­ным обменом, — инсулину, который синтезируется под­желудочной железой. Наследственный или приобретен­ный дефицит инсулина приводит к тяжелой болезни — диабету, в старину называвшемуся «сахарной бо­лезнью».

Инсулин — небольшой белок, состоящий из двух по­липептидных цепочек, соединенных мостиками из двух атомов серы. Он практически не вызывает у нормаль­ных людей реакцию отторжения, не является антиге­ном. Поэтому еще в начале нашего века лечили впрыски­ванием раствора инсулина, выделенного из поджелудоч­ных желез рогатого скота и свиней. Тем не менее ген инсулина теперь клонирован в кишечной палочке, и в ряде стран в продаже появился человеческий инсулин. Ведь свиной и коровий инсулин несколько отличается по составу от человеческого и у некоторых больных вызы­вает аллергическую реакцию.

С другими гормонами белковой природы дело обстоя­ло хуже, все они оказались видоспецифичными.

Чужим гормоном роста — соматотропином, напри­мер, нельзя лечить гипофизарный карликовый рост человека: возникает антигенная реакция.

В настоящее время клонированы гены не только че­ловеческого соматотропина, но и его антагониста — со­матостатина, который регулирует рост и управляет син­тезом гормонов поджелудочной железы — инсулина и его антагониста — глюкагона. Теперь возможно не толь­ко лечить карликовый рост, но при необходимости и тор­мозить избыточный рост. Такие случаи отмечаются, например, при аденоме — доброкачественной опухоли передней доли гипофиза. У человека тогда начинается акромегалия: непропорционально разрастаются хряще­вые концы длинных костей и челюсти. Причина акро­мегалии — избыточный синтез гормона роста у взросло­го человека.

У нас получен человеческий соматотропин, клониро­ванный в кишечной палочке. Он будет использоваться только для лечения карликовости, а не просто невысоко­го роста, что болезнью не является (рис. 40).

Нормальная мышь (слева) и мышь, которой ввели гормон роста крысы...

Нормальная мышь (слева) и мышь, которой ввели гормон роста крысы…

Один из авторов этой книги в 1982 г. получил пись­мо от девушки невысокого роста. Чувствуя себя не очень уютно среди современного поколения акселера­тов, она хотела подрасти с помощью гормонов. Напрас­но я писал ей, что малый рост отнюдь не уродство, даже цитировал Р. Бернса. Корреспондентку мою, кажется, убедили не стихи великого шотландского поэта, а опас­ность вместе с высоким ростом получить признаки акромегалии — патологически длинные руки и ноги и «лошадиную» челюсть.

Наоборот, сейчас ученые, например в ГДР, ставят вопрос о необходимости как-то притормозить акселера­цию подрастающего поколения, хотя бы инъекциями соматостатина. Ведь двухметровые акселераты, которых становится все больше, нередко оказываются болез­ненными, менее устойчивыми к неблагоприятным факто­рам внешней среды. По-видимому, предел оптимального роста для мужчин около 180 см, а у женщин существен­но меньше. Это только один из примеров, когда клони­рованные гены гормонов находят применение в медицине. Но в организме немало и других белков-регуляторов, роль которых мы только еще начинаем открывать.

Не менее интересны недавно открытые энкефалины — крошечные, всего из пяти аминокислотных остатков пеп­тиды, по-видимому, обломки более крупных белков. К примеру у подопытных крыс эти пентапептиды улуч­шают память. Концентрация энкефалинов в спинномоз­говой жидкости у людей с нарушениями психики изме­няется.

Интерес невропатологов и психиатров вызывают эндорфины (эндо — «внутри», т. е. синтезируемые внутри организма морфины) — пептиды с действием, похожим на действие опиатов, т. е. таких опасных наркотиков, как морфин, опий, героин. Эндорфины синтезируются в тканях мозга. Их содержание также изменяется при психических заболеваниях. По-видимому, состояние психики человека, его душевное здоровье, зависит от рав­новесия концентраций эндорфинов и энкефалинов и их антагонистов. Невропатологи и психиатры полагают, что в ближайшее время в лечении нервных заболеваний произойдет революция, которую можно сравнить лишь с началом эры антибиотиков. А получить белковые фак­торы регуляции нервной деятельности в достаточных ко­личествах можно только с помощью методов генной инженерии.

Новые лекарства для лечения нервных расстройств имеют большой спрос. Во второй половине XX в. ритм жизни чудовищно ускорился. Всем нам не хватаем вре­мени, все мы спешим, порой принимаем решения наспех, а затем переживаем последствия. Слово «стресс» стало модным, все мы стремимся каким-то образом снять последствия перегрузок нервной системы. Химики разра­ботали немало соединений, снимающих нервное напря­жение, — транквилизаторов, в частности широко извест­ный тазепам. К сожалению, транквилизаторы небезвред­ны, да и перестают действовать, когда организм к ним привыкает.

Физиологи нашли на оболочках нервных клеток осо­бые белки-рецепторы, к которым присоединяются моле­кулы тазепама. Оказалось, что транквилизатор активи­рует рецептор, и в клетке начинается синтез гамма-аминомасляной кислоты, которая снимает возбуждение нервной системы. Отсюда следовало, что имеются какие-то природные аналоги транквилизаторов со сходным дей­ствием. Человек перевозбуждается просто потому, что их ему не хватает.

Американские исследователи во главе с Э. Коста по­пытались их найти и в конце концов получили из моз­говой ткани крыс довольно крупный (105 аминокислот) пептид, практически маленький белок, который присое­динялся к клеточному рецептору. Однако действие его было противоположным: он усиливал нервное возбужде­ние, за что получил выразительное прозвище «пептид страха».

Сам по себе «пептид страха» обещает многое: ведь медицине хорошо известны случаи, когда нервная систе­ма патологически заторможена и ее нужно возбудить. Но группа Э. Коста была огорчена: они искали совсем не то. Стало ясно, что этот пептид, а вернее его активный центр из 18 аминокислотных остатков, конкурирует с искомым природным транквилизатором, присоединяясь к клеточному рецептору. Структура желанного пептида должна была быть близкой. Поэтому сотрудники Э. Кос­та по уже известной аминокислотной последовательности синтезировали искусственный ген «пептида страха». Гиб­ридизуя его с ДНК человека и крысы, они «выловили» несколько генов очень сходных пептидов, которые ока­зались активными, способными к транскрипции, не толь­ко в мозгу, но и в других органах. Теперь дело упрощает­ся. Можно пустить в ход весь арсенал генной инженерии и получить пептиды-антагонисты, действие которых об­ратно действию того, что выделен первым, т. е. «пеп­тиду страха». Можно получить и антитело к «пептиду страха». Тогда появилась бы возможность лечить нерв­ный стресс прививкой, как корь — коревым гамма-глобулином. Заманчивая перспектива!

Расскажем об аномальных ферментах, вызывающих унаследованные от родителей заболевания. Есть тяжелая наследственная болезнь — фенилкетонурия, при которой организм больного неспособен превращать одну из ами­нокислот — фенилаланин в другую — тирозин. Избыток фенилаланина приводит к ослаблению пигментации ко­жи и волос (тормозится синтез пигментов — меланинов). Однако не это главное. При фенилкетонурии производ­ные фенилаланина — органические кислоты с аромати­ческим ядром — отравляют мозговую ткань, приводя к слабоумию. Аллель гена, вызывающий фенилкетону­рию, встречается по подсчетам ученых у 0,5% населения.

Единственно надежный в настоящее время способ предотвращения фенилкетонурии — диета с предельно низким содержанием фенилаланина (полностью исклю­чить его нельзя, так как это незаменимая для человека аминокислота). Для детей с этим наследственным дефек­том ядовито даже материнское молоко — их нужно вскармливать на искусственной смеси с низким содер­жанием фенилаланина. Диагностировать фенилкетону­рию сразу после рождения ребенка очень просто: до­статочно приложить к мокрой пеленке бумажку, пропитанную раствором хлористого железа — моча ребенка даст зеленую окраску.

Изготовление искусственных смесей в массовом масштабе обходится дорого. Но несравненно дороже содержание больных с тяжелыми психическими и физи­ческими нарушениями. А если недостающий фермент вводить в кровь больному? К сожалению, инъекции малоэффективны: слишком быстро фермент разрушается в крови. Разработан иной прием. Известно, что фер­менты, закрепленные на твердом носителе (иммобилизо­ванные), более устойчивы. Исследователи предложили нужный фермент закреплять на внутренней поверхно­сти нейлоновых трубок. Система таких трубок (реакто­ров) присоединяется между бедренной артерией и ве­ной; кровь, проходящая через нее, освобождается от избыточного фенилаланина. Такие реакторы были бы очень полезны для лечения в период резкого обострения болезни. На собаках они уже испытаны. По этому пути пойдет, очевидно, медицина — до тех пор, пока генные инженеры не разработают безопасный способ включе­ния «здоровых» генов в геном человека, т. е. пока не создадут генную хирургию.

Другой пример «больного» гена и кодируемого им «больного» фермента — ген одного из ключевых фер­ментов пуринового обмена у человека. Он имеет длин­нейшее название: гипоксантингуанинфосфорибозилтран­сфераза (сокращенно ГГФРТ). В человеческих популя­циях встречаются разные аллели этого гена, продуци­рующие фермент большей или меньшей активности. Чем хуже работает ГГФРТ, тем больше мочевой кисло­ты накапливается в организме. Наиболее «безобидный» аллель вызывает подагру (соли мочевой кислоты плохо растворимы; кристаллы их, накапливаясь в суставах, вызывают мучительные боли). Если аллель продуцирует фермент худшего качества, возникает почечно-камен­ная болезнь, а затем сильнейшее отравление мочевой кислотой — гиперуринемия.

Если фермент не работает совсем или ген заблокиро­ван, наступает тяжелая болезнь. У детей, пораженных этой болезнью, сильная умственная отсталость, спин­номозговые параличи. До недавнего времени такие де­ти были обречены. Лишь сейчас появилась надежда: Д. Миллер (США) встроил нормальный ген ГГФРТ в РНК-содержащий вирус (ретровирус) и ввел в спинной мозг мышей. И там стал синтезироваться человече­ский ГГФРТ! Д. Миллер предполагает приспособить ви­рус со встроенным геном для размножения в организме больных; к сожалению, трудность в том, что многие рет­ровирусы потенциально канцерогенны: встраиваясь в ге­ном, они могут стать причиной роста злокачественной опухоли. Это уже попытка генной хирургии, попытка вставить «здоровый» ген в организм наследственно больного человека.

Больший успех пока имеют те исследователи, которые пошли по проторенному пути лечения чужим белком (т. е. человеческим, но выращенным в микроорганизме с клонированным геном). Но есть и другие пути. Мы упоминали о тяжелой наследственной болезни гемо­филии, при которой у человека кровь плохо свертывается. Причина этого — отсутствие в крови полноценного бел­ка свертываемости, так называемого фактора VIII. Это огромный белок из 2351 аминокислотного остатка, синте­зируемый клетками печени. Сейчас больных гемофилией лечат введением крови доноров. Но таким путем их мож­но заразить вирусом гепатита или, того хуже, вирусом СПИД, о котором мы еще будем говорить. Надежнее на­рабатывать в микроорганизмах чистый фактор VIII.

Недавно ген фактора VIII был отклонирован и изучен. Это самый большой из известных индивидуальных генов. Его длина — 180 тыс. пар нуклеотидов! Напомним для сравнения, что в гене интерферона всего 600 пар нуклео­тидов. И тем не менее уже через 3—4 года ученые на­деются создать доступный каждому больному препарат чистого фактора VIII. Особенно важно это для разви­вающихся стран, где продолжительность жизни боль­ных гемофилией не превышает 20 лет. Можно и вообще избежать появления на свет больного ребенка.

Медицинские генетики дают консультации обратив­шимся к ним будущим матерям. В роду матери (или отца) наблюдались случаи гемофилии (или иной тяже­лой наследственной болезни). Какова вероятность рожде­ния больного ребенка в данном случае? Генетик сейчас производит нехитрые расчеты, основанные на менделев­ской формуле 3:1, и говорит: вероятность рождения боль­ного, например, 25%. Слишком многое зависит от этой генетической лотереи, и воля родителей: смириться с риском или прервать беременность.

Однако методы генной инженерии позволяют со 100%-ной вероятностью сказать, будет ли еще неродив­шийся ребенок больным или здоровым. Разработан ме­тод дородовой диагностики. Допустим, нужно решить, не­сет ли в себе развивающийся в организме матери зародыш ген гемофилии. Врач берет шприцем пробу околоплодной (амниотической) жидкости, в которой до момента рождения плавает развивающийся эмбрион. В ней всегда имеются отдельные клетки зародыша, как бы «слущенные» с его поверхности. Их можно размно­жить на питательной среде, выделить из них ДНК и гибридизовать ее с клонированной ДНК генов «больного» и нормального. И вывод будет не вероятностным, а точ­ным. Конечно, такой сложный анализ сейчас большин­ству клиник недоступен. Не хватает оборудования, реак­тивов, квалифицированных сотрудников, владеющих методами генной инженерии.

Генная инженерия и рак. Рассмотрим теперь, что да­ла генная инженерия онкологии, той отрасли медицины, которая занимается лечением больных раком, злокаче­ственными опухолями. Этот страшный недуг, так же как и сердечно-сосудистые заболевания, сейчас вышел на первое место.

И хотя скальпель хирурга, радиоактивное излучение, химиотерапия позволяют существенно продлить жизнь больного, а в некоторых случаях практически вылечить его, окончательная победа над раком еще далека.

Что происходит в организме больного раком? Во­прос этот можно сформулировать иначе: чем клетки злокачественной опухоли отличаются от нормальных, здоровых клеток? Начнем с того, что каждая здоровая клетка может делиться строго определенное количест­во раз, а потом теряет способность к митозу и погиба­ет. Опухолевые клетки обладают способностью к не­ограниченному росту. Именно поэтому они растут в ущерб организму больного, в конце концов приводят его к гибели и часто переживают его, разводимые в куль­туре, на питательной среде. Вторая особенность опухо­левого роста — метастазирование: образование мно­жественных вторичных очагов поражения — метаста­зов. Объясняется это тем, что отдельные клетки, отде­лясь от опухоли, могут мигрировать по лимфатической и кровеносной системе и размножаться в других местах, вдали от первичной опухоли.

Практически все клетки организма, способные к митозу, способны и к злокачественному перерождению. Многого мы еще не знаем. Почему, например, рак мо­лочной железы дает метастазы чаще в костную ткань? Почему селезенка, источник рака крови — лейкозов, довольно редко метастазируется сама?

Сейчас все исследователи пришли к выводу, что рак — это нарушение регуляции работы генов. К со­жалению, это положение выглядит очень общим. Ка­кой же фактор, внутренний или внешний, вызывает это нарушение регуляции? В чем заключается это наруше­ние?

По одной теории рак может вызываться самыми раз­ными факторами — и внешними, и внутренними. Как проверить такую теорию экспериментом? Дело не в факторе, а в природе самой делящейся клетки. Так и пожар может возникнуть и от небрежно брошенного окурка, и от удара молнии, и самовозгорания.

По другой теории, мутагенной, рак — это сомати­ческая мутация, не передающаяся по наследству, воз­никающая в соматических клетках организма. Она ка­залась очень вероятной, так как прием многих мутаге­нов вызывал у подопытных животных рост опухолей.

Еще одна, канцерогенная, теория утверждала, что разлад регуляции работы генов обусловливается кан­церогенами — факторами, способными вызывать рак. Чаще всего ароматическими углеводородами и их про­изводными, содержащимися, например, в каменно­угольной смоле, асфальте, выхлопе автомобилей и та­бачном дыму. Она одна из первых получила подтвер­ждение на практике: еще в старину рак кожи считал­ся профессиональной болезнью лондонских трубочис­тов (камины тогда топили каменным углем). В даль­нейшем оказалось, что канцерогены активно взаимодей­ствуют с ДНК клеток, и канцерогенная теория начала сливаться с мутагенной.

Самую оригинальную, вирусно-генетическую тео­рию выдвинул Л. А. Зильбер, о котором мы уже писа­ли, чей опыт, выполненный в 20-е годы, лежит в исто­ках генной инженерии. Согласно Л. А. Зильберу, ну­клеиновая кислота вируса, включаясь в геном клетки, изменяет регуляцию генов в ней и делает клетку способ­ной к неограниченному злокачественному росту.

Долгое время никто не верил в существование опу­холеродных вирусов, хотя первые сообщения о них появились еще в начале нашего века. Оригинальная ги­потеза Л. А. Зильбера была подтверждена в 50-х го­дах американским вирусологом Р. Дальбекко, кото­рый трансформировал опухолевые клетки грызунов, заражая их обезьяньим вирусом SV-40. Многие опухо­ли и лейкозы оказались связанными с вирусами. За­трудняло исследователей то, что большинство этих ви­русов были РНК-содержащими. Что же, РНК включа­ется в геном, состоящий из ДНК?

Только в 1970 г. Г. Темин и Д. Балтимор открыли фермент — обратную транскриптазу (ревертазу), син­тезируемый РНК-содержащими вирусами. Такие виру­сы назвали ретровирусами. Ревертаза синтезирует ДНК на матрице РНК, которая может включаться в ге­ном. За это открытие в 1975 г. оба этих ученых вместе с Р. Дальбекко были удостоены Нобелевской премии.

Вирус в РНК-вой форме может долго размножать­ся в клетках, не делая их злокачественными; но пере­ходя в ДНК-содержащую форму, он может интегриро­ваться в геном — и последствия для организма могут быть печальными. А ДНК-вые вирусы для интеграции в геном не нуждаются в помощи ревертазы. Потен­циально канцерогенными считаются многие вирусы; среди них такие распространенные, как аденовирусы. Размножаясь в клетках слизистой носоглотки, адено­вирусы вызывают разнообразные болезни, которые медики называют острыми респираторными заболева­ниями (ОРЗ). По крайней мере, один из четырех ви­русов, вызывающих у человека бородавки, обладает онкогенной, или канцерогенной, активностью.

Все дальнейшие успехи в изучении механизма зло­качественного роста неразрывно связаны с генноинже-нерными методами. Именно благодаря им онкология совершила блестящий прорыв в область неведомого.

Оказалось, что онковирусы содержат последователь­ности РНК (или соответственно ДНК), кодирующие белок, который трансформирует нормальную клетку в злокачественную. Таких последовательностей извест­но много. Их назвали онкогенами, а продукты их транс­ляции — онкобелками. Активные онкогены обнаруже­ны во многих опухолях. Сокращенно их называют ras, myc, Blym, myb, fos и т. д. — всего более 20.

Онкоген вируса активен у саркомных вирусов, толь­ко если на концах генома имеются особые длинные повторы. Их назвали LTR (long terminal repeats). Сами они белков не кодируют, но без них онкоген «молчит». Чистыми онкогенами или ДНК, выделенной из опухо­левых клеток, можно трансформировать нормальные клетки в злокачественные, и вероятность перерождения резко возрастает при добавке LTR (рис. 41).

Схема выделения онкогена...

Схема выделения онкогена…

Онкологи-экспериментаторы были изумлены мето­дом молекулярной гибридизации ДНК, обнаружив онкогены в нормальных клетках всех животных — от низших червей до человека. Они получили название протоонкогенов, т. е. первичных генов рака. Название в общем бессмысленное, ведь не для вызывания рака они существуют в геноме. Что же делают протоонкогены в нормальных клетках?

Оказалось, что в норме они активны лишь на опре­деленных стадиях развития. Это было показано на эм­брионах мышей. Например, протоонкоген fos работает до стадии восьмидневного зародыша, затем его сме­няет протоонкоген raski, а за ним аbl. Это регулятор­ные гены, которые, когда не нужны, «молчат», а в пе­риод активности нарабатывают не более 20—30 моле­кул мРНК на клетку. Любопытно, что некоторые онко­белки по структуре похожи на факторы роста клеток. Например, онкоген вируса саркомы обезьян кодирует белок, очень похожий на фактор роста, синтезируемый в нормальных тромбоцитах, тех клетках, которые «за­делывают бреши» в кровеносных сосудах.

В каких случаях протоонкоген теряет приставку «прото»? Это случается прежде всего, если к протоонкогену присоединяется сильный промотор — вирусный LTR. Мутация самого протоонкогена также делает его сверхактивным, и это уже доказано. Одна мута­ция в протоонкогене ras приводит к тому, что двенад­цатая аминокислота в онкобелке — лейцин — заме­няется на валин, что приводит к возникновению кар­циномы мочевого пузыря. Хромосомные мутации, возникающие вследствие транслокации (обмен участка­ми между негомологичными хромосомами), также при­водят к тому же результату. Иногда подобные струк­турные перестройки внутри самого протоонкогена так­же его активируют. Наконец, возможна и амплифика­ция — умножение копий онкогена.

Любопытно, что продукты разных протоонкогенов в нормальных клетках выполняют разные функции: онкобелки могут быть и ядерными, и связанными с кле­точной мембраной; среди них есть и факторы роста, и ферменты. А результат их активации один: клетка приобретает способность к злокачественному, беспре­дельному размножению.

Новые данные имеются и о природе клеток, сла­гающих метастазы. По-видимому, это не простые клет­ки-мигранты, оторвавшиеся от первичной опухоли и приплывшие с током крови или лимфы в другое место. Иногда они разные. Например, протоонкогены myb и sis в первичных опухолях «молчат», но активируются довольно часто в метастазах.

Какая же теория происхождения рака подтверди­лась? Все они оказались верными! Действительно, рак может вызываться разными внутренними факторами — протоонкогенами. Активируются они в результате раз­ных мутаций, в том числе и вызываемых внешними факторами — канцерогенами. И наконец, сверхактив­ный, «одичавший» онкоген может быть внесен в геном в составе вируса. Такие случаи, когда разные теории мирно сосуществуют, объединенные одной концепци­ей, в науке редки. Просто раньше ученые затрагивали разные стороны одной большой проблемы и полемизи­ровали, как в восточной притче слепцы спорили, на что похож слон: на колонну, змею, хлопушку от мух или одеяло (один ощупал ногу, другой — хобот, третий — хвост, четвертый — ухо). И все были правы, но ни один до конца.

Остановимся особо на одной из форм злокачествен­ного роста — лейкозах, когда в крови появляются в изобилии недозревшие лейкоциты, не выполняющие своих функций. Теперь описано много форм лейкозов и вирусов, которые могут их вызывать. Наиболее хоро­шо изучен вирус Т-клеточного лейкоза, поражающий Т-лимфоциты человека. Он известен под названием HTLV-1 (human T-ceel leucaemia virus). Впервые его обнаружили в Японии, и он сразу заинтересовал иссле­дователей тем, что поражал тимусные лимфоциты той разновидности, которые называют Т-хелперы (от анг­лийского to help — помогать). Эти лимфоциты выра­батывают особые вещества — переносчики иммунно­го сигнала к другим разновидностям лимфоцитов. Эти клетки — «главный штаб» иммунной системы; их и выводит из строя вирус, вызывая злокачественное бе­локровие.

Похожее заболевание вскоре было обнаружено в США. Сходные ретровирусы обнаружены у обезьян Старого Света, очень близок к ним вирус лейкоза круп­ного рогатого скота, приносящий немалые убытки во многих странах. По-видимому, все эти вирусы — род­ственники. Их коварство заключается в том, что инку­бационный период может длиться очень долго (десят­ки лет!).

К счастью, сейчас разработаны очень чувствитель­ные иммунологические методы, позволяющие обнару­жить одну молекулу вирусного антигена в 1 мл сыво­ротки крови. Широкое использование их в клинике по­зволит выявить носителей вируса и приступить к лечению. К сожалению, самая страшная история впе­реди.

К той же группе ретровирусов относятся вирус ане­мии лошадей и близкий к нему вирус, вызывающий пе­чально известный СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита. Впервые он выявлен в США. В 1985 г. численность обнаруженных больных в этой стране превысила 13 тыс. Теперь случаи заболевания описа­ны для более чем 40 стран. За четыре года после диаг­ноза 50% больных погибли от самых разных болезней. Ведь вирус СПИД, или, как его называют медики, HTLV-3, вызывает не злокачественное перерожде­ние лимфоцитов-хелперов, а разрушает, убивает их, нанося удар в «сердце» иммунной системы. Вот поче­му больной беззащитен от любой инфекции и разви­тия любой злокачественной опухоли. Люди со СПИДом болеют болезнями, совершенно не свойственными здо­ровому человеку, и формами опухолей, присущих ра­нее лишь очень пожилым людям. В строгом смысле слова СПИД нельзя назвать раком. Но вирусы Т-кле-точного лейкоза и иммунодефицита крайне близки. Посмотрите на схемы строения их геномов (рис. 42). У обоих в начале и конце расположены длинные повто­ры — LTR. Дальше идут ген gag, кодирующий внут­ренние белки вирусной частицы, pol — ген ревертазы и env — ген белков оболочки (рис. 42). Различие в том, что у вируса лейкоза за env идет ген X—IV, вызы­вающий злокачественное перерождение лимфоцита, а у вируса СПИД после pol и env — гены Q, F, ответствен­ные за гибель и разрушение хозяйской клетки.

Схема строения геномов вирусов Т-клеточного лейкоза и иммунодефицита

Схема строения геномов вирусов Т-клеточного лейкоза и иммунодефицита

Передается СПИД беспорядочными половыми свя­зями. Наркоманы заражаются им через шприцы. А так как в США донорство платное и невыявленные носители СПИДа зарабатывают им себе на жизнь, за­разиться можно и в клинике при переливании крови или введении сыворотки.

HTLV-3 — странный вирус: ведь в Центральной Африке близкий штамм его поражает и мужчин, и жен­щин, и детей. Там СПИД ограничен и никогда не при­обретал характер эпидемии.

Перейдем к практической стороне изучения злока­чественных опухолей.

Врачи давно подметили, что заражение некоторыми болезнетворными бактериями тормозит развитие раковых клеток, вызывая иногда даже ремиссию (рас­сасывание) опухолей. На этом наблюдении был разра­ботан метод лечения: больному вводили смесь убитых бактерий, например синегнойной палочки. Однако о нем забыли, когда в практику медицины вошли облу­чение и химиотерапия — методы гораздо более эффек­тивные.

О старом методе вспомнили, когда выяснили, что вещества убитых бактерий не прямо действуют на клетки опухоли, а каким-то образом стимулируют клетки иммунной системы — макрофаги. Эти амебо­образные клетки, образующиеся в красном костном мозге, еще И. И. Мечников называл фагоцитами. Они заглатывают в крови и соединительной ткани, альвео­лах легких и брюшной полости чужеродные клетки. Кроме того, липополисахариды убитых бактерий сти­мулируют в макрофагах синтез фактора, вызывающе­го некроз опухолей. Его и назвали по-английски TNF (tumor necrosis factor).

TNF оказался белком из 157 аминокислотных остат­ков. Он видоспецифичен: лишь 80% последовательно­сти мышиного TNF гомологично человеческому. В макроцитах он синтезируется в виде белка-предшествен­ника в 233 остатка и, лишь выходя из клетки, обрета­ет активность.

Нашелся и другой белок сходного действия, синте­зируемый лимфоцитами. Оба фактора усиленно изуча­ются сразу в нескольких лабораториях США и СССР. Гены их клонированы в кишечной палочке. Показано, что введение TNF мышам с мышиной саркомой приво­дит к разрушению клеток опухоли. Дело за клиниче­скими испытаниями препаратов.

Другой путь — стимуляция самих макрофагов. Получены факторы, более эффективно стимулирующие синтез TNF, чем смесь убитых бактерий.

Вообще в последние годы распространилось убеж­дение, что мы недооценивали роль иммунной системы в защите организма от злокачественных опухолей. Неда­ром в условиях, когда эта система ослаблена, вероят­ность заболеть разными формами рака возрастает. К примеру, среди 18 тыс. жителей Хиросимы, остав­шихся в живых, но облученных, резко возросла забо­леваемость лейкозом. Опухоли чаще наблюдаются у пожилых и у людей с врожденным иммунодефицитом. Наконец, люди с пересаженными почками и сердцами, у которых иммунное отторжение подавляется искус­ственно, заболевают раком значительно чаще здоро­вых людей.

К сожалению, как мы видим, иммунный ответ час­то дает осечку и не только у пожилых людей. Опухо­левые антигены обычно слабые и сильного иммунного ответа не вызывают. Мы уже говорили, что антитела на опухолевые клетки часто облепляют их и потому, меченные изотопом, используются для диагностики. Но убить вышедшую из повиновения организма клет­ку они не в состоянии. Поэтому в тех случаях, когда бессилен хирург и облучение не дает результатов, а так­же нет надежды на иммунный ответ, врачи прибегают к химиотерапии. Известны многие десятки веществ, тормозящих рост опухолей. Обычно это реактивы, по­давляющие синтез нуклеиновых кислот, реже белков и других веществ, необходимых для роста клеток, в том числе и опухолевых. Современный арсенал средств хи­миотерапии настолько обширен, что при разумном их употреблении можно подавить рост большинства форм злокачественных опухолей и продлить жизнь больного на 5—10 лет, а то и больше.

Однако и химия не всесильна. Все разработанные ею средства отличаются малой избирательностью. Любой яд, убивающий раковую клетку, опасен и для нормаль­ной. Клетки опухоли просто более уязвимы, потому что растут и делятся быстрее. Но высокие концентрации химиотерапевтических средств применять нельзя: они будут убивать нормальные клетки — и в первую оче­редь опасность грозит иммунной системе! А низкие кон­центрации ядов — мощный фактор отбора. Среди раз­множающихся клеток опухоли врач-онколог попросту проводит отбор на устойчивость к применяемому им лекарству, и, как правило, с успехом.

Много надежд онкологи возлагали на метотрексат. Это вещество подавляет синтез пуринов — одного из основных компонентов ДНК (основания А и G). Ме­тотрексат — специфический отравитель одного из фер­ментов, участвующих в этом процессе. В результате лечения этим препаратом опухоль прекращает рост, рассасывается. Но победу праздновать рано. Допусти­мые в клинике дозы метотрексата отбирают в опухо­ли устойчивые клетки. Лекарство теряет эффективность, а устойчивая опухоль опять начинает расти. Повысить дозу метотрексата нельзя, она и так на пределе допус­тимого.

Получается, что мы имеем два метода воздействия на опухоль. Один из них — активация клеток иммун­ной системы интерфероном или другими агентами. Лим­фоциты и синтезируемые ими антитела обладают иде­альной точностью наведения, специфичностью. Они атакуют только опухолевые антигены. К сожалению, их сил не хватает, чтобы расправиться с раковыми клет­ками.

Второй — химиотерапевтический. Вещества, приме­няемые в нем, могут убить раковые клетки, но они не обладают специфичностью. Вот если бы объединить оба метода, чтобы достоинства их слагались, а недо­статки взаимно компенсировались! И такие методы успешно разрабатываются. Здесь снова придется вер­нуться к гибридомам.

Допустим, получено достаточное количество моно­клонального антитела на поверхностный антиген рако­вой клетки. С помощью химической модификации при­соединим к молекулам антитела сильный яд и введем больному. Антитела найдут злокачественные клетки, облепят их, а яд поразит цель. Нормальные клетки оста­нутся нетронутыми, зато средство поразит все мельчайшие метастазы, притаившиеся в организме. Такие гибридные молекулы можно сравнить с боевой ракетой точного индивидуального наведения, где роль боего­ловки играет токсин.

Перспективен для этой цели сильный белковый яд — токсин клещевины — рицин (той самой клещевины, из которой добывают всем известную касторку). Есть и другие вещества, не менее пригодные. В принципе, используя массированную атаку моноклональным анти­телом, можно подавить раковые клетки и без помощи токсина. Схема такого лечения одной из форм рака показана на рисунке 43.

Схема лечения человека, больного иодулярной лимфомой...

Схема лечения человека, больного иодулярной лимфомой…

Не очень трудно наладить производство гибридом для целей диагностики. Но для лечения тех же болез­ней моноклональных антител потребуется в тысячи раз больше! Требуется создание мощной отрасли ме­дицинских препаратов, причем она должна не «гнать вал», а практически выполнять индивидуальные заказы — делать антитела на разнообразнейшие белко­вые антигены. Сложнейшая задача!

Дело в том, что мышиные гибридомы (т. е. гибри­ды клеток миеломы мыши и лимфоцитов той же мыши или человека) получить легко, а сохранить трудно. Они генетически нестабильны и легко теряют хромосо­мы, в том числе и с геном нужного антитела. Были бы гораздо устойчивее гибридомы типа человек X человек. Но для этого необходимо найти легко гибридизующие­ся и устойчивые в культуре злокачественные клетки человека. Поиски таких клеток человека (и кролика, он тоже удобнее мыши) ведутся, и получены уже пер­вые успехи.

Онкологи и генные инженеры, вероятно, не оставят разгадку эффективного лечения рака в XXI в. Сейчас большинство сил в этой области разрабатывает «золотую жилу» онкогенов. Направление перспективное, но не следует забывать и о других подходах. Сейчас в Гарвард­ском университете (США) сделано важное открытие. Оказалось, что опухоль активно синтезирует регулятор­ный белок — ангиогенин, стимулирующий рост мел­ких кровеносных сосудов — капилляров. В результате опухолевые клетки пользуются интенсивным крово­снабжением, именно поэтому быстро растут!

Когда ген ангиогенина будет клонирован (а этот белок, как и всякий регулятор, эффективен при нич­тожных концентрациях — до миллиономиллиардной доли грамма!), его можно будет использовать для лече­ния болезней, вызванных недостаточным кровоснабже­нием (последствия инфаркта, инсульта, ишемической бо­лезни сердца, заживление трофических язв, язв желуд­ка и кишечника). Еще перспективнее найти ингибитор, подавляющий синтез ангиогенина или его деятельность. Вводя такой ингибитор в опухоль, можно быстро по­давить ее кровоснабжение; тогда она перестанет расти и начнет рассасываться. Сам ангиогенин — белок не­большой (123 аминокислотных остатка), его можно при­соединить к моноклональному антителу и послать в нужное место организма (например, к сердцу, пора­женному инфарктом). Добавим, что есть и другие ори­гинальные подходы к лечению злокачественных опухо­лей. Мы уже писали о разновидности Т-лимфоцитов — клетках-«убийцах» — киллерах. Их можно активиро­вать и размножить в культуре. Сотрудники Национального института рака (США) выделяли киллеры из ткани опухоли, удаленной во время операции, и обраба­тывали иммунным гормоном — интерлейкином-2, ко­торый, как вы помните, вырабатывается клетками — хелперапи. Затем размноженные в культуре киллеры вводили в организм. Через 15 дней рассасывались опу­холи толстого кишечника, метастазы в печени и легких; организм приобретал стойкий иммунитет к клеткам собст­венной опухоли. Правда, пока все это проделано на мышах.

По другому методу подавлялась способность опухоле­вых клеток перемещаться в организме, образуя мета­стазы. В том же институте удалось выделить из клеток меланомы человека белок — фактор миграции, повы­шающий подвижность клеток. В норме он полезен: под его действием клетки соединительной ткани, «сполза­ясь», закрывают раны (в том числе и на сердце при инфаркте миокарда). У раковых больных концентрация этого белка в крови резко повышается. Уже разраба­тываются методы применения антител к фактору миг­рации как для ранней диагностики рака, так и для подавления способности опухоли к метастазированию. А нарощенный биотехнологическими методами этот бе­лок обещает стать хорошим средством для быстрого заживления ран и инфарктов миокарда.

Наш обзор далеко не полный. Но мы надеемся, что читатели поймут: генноинженерные методы произве­ли революцию в медицине. Чтобы мы могли восполь­зоваться плодами этой революции, нужно активно внедрять их в практику. И не вам ли в будущем пред­стоит это сделать?