1 рік тому
Немає коментарів

Sorry, this entry is only available in
Російська
На жаль, цей запис доступний тільки на
Російська.
К сожалению, эта запись доступна только на
Російська.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

Генноинженерные методы наиболее перспективны в сельском хозяйстве, особенно в растениеводстве. Ра­стения очень удобный объект для генных инженеров.

Клетки высших растений, в том числе и культурных, можно размножать на твердой и жидкой среде в культу­рах. Мы уже писали, что так теперь размножают, кроме микроорганизмов, и клетки высших животных, напри­мер человека. Наилучший эффект давали среды с экзо­тическими добавками, вроде молока кокосового ореха. Теперь разработаны среды дешевые и надежные, позво­ляющие наращивать большую биомассу растительных клеток с неизмененными свойствами. Все вы слыхали о «корне жизни» — женьшене, из которого получают чудодейственные лекарства. Оказалось, что выгоднее клетки женьшеня наращивать искусственно, в фер­ментерах, а не создавать плантации (и тем более искать в дальневосточной тайге).

К культивируемым растительным клеткам примени­мы все методы промышленной микробиологии, включая отбор клеток, интенсивно синтезирующих нужное веще­ство. Так были получены штаммы клеток растений рау­вольфии змеиной — продуцента алкалоидов, снижаю­щих кровяное давление, руты душистой, вьюнка, на­перстянки, мяты и многих других. В Японии научи­лись растить на искусственной среде клетки шелковицы, а потом их добавлять в синтетические корма для тутового шелкопряда. Это в принципе позволяет разводить шел­ковичных червей где угодно, даже на Северном полюсе. Оказалось, что шелкопряды могут есть самый разнооб­разный корм, лишь бы от него пахло шелковицей.

Но главное даже не в этом. Растительные клетки, в отличие от животных разводимые в культуре, сохраняют способность в соответствующих условиях дифференци­роваться, превращаться в целое растение, которое мож­но потом высаживать и размножать семенами. Клетки в культуре можно сохранять в жидком азоте десятки и сотни лет, а затем превращать в целые растения и возвращать на поля. В клеточных культурах гораздо быстрее вести отбор на продуктивность, устойчивость к вредителям и отбирать нужных мутантов. Наконец, в культуры клеток очень удобно встраивать чужие гены, а затем получать растения с нужными свойствами.

Затруднение в том, что растительные клетки, как и клетки дрожжей, одеты в прочные и труднопроницае­мые оболочки. Но растительную клетку, как и дрожже­вую, можно «раздеть», обработав ферментами, гидролизующими целлюлозу. Так получают протопласты, до­ступные для внешних воздействий, например трансфек­ции плазмидами. Потом протопласт сам по себе вос­станавливает оболочку и превращается в нормальную клетку.

Протопласты в культуре могут сливаться. Так можно гибридизовать клетки, причем не только одного вида. Гибридизуются и животные клетки: в культуре получе­ны гибридные клетки мыши и крысы, мыши и человека и даже человека и комара. В отличие от животной единичную клетку растения можно превратить в целый организм. Так были получены гибриды разных видов та­бака, картофеля, томата, петунии, белладонны, моркови, сои и гороха, гороха и бобов. Но межсемейственные гиб­риды превратить в целые растения не удается: слиш­ком разные геномы объединяются в гибридной клетке, поэтому таким способом нельзя вырастить «на вербе груши». К тому же такой путь не очень перспективен: как вы знаете из первой главы, кроме нужного гена, мы получаем тысячи ненужных. Перспективнее генно­инженерный путь: вставка отдельно взятого гена или системы генов, интегрированных в векторе. Культуры клеток и тканей растений открывают путь к решению сверхважной для сельского хозяйства проблемы. Ее можно выразить двумя словами: «безвирусное растение­водство».

Как освободить растения от вирусов. Растения могут поражаться многими сотнями вирусов. Обычно это РНК-содержащие вирусы, хотя, как выше отмечалось, в недавнее время открыты и ДНК-вые. Не все фитовиру­сы убивают растение, но практически все резко сни­жают рост, развитие и урожайность. Особенно страдают от фитовирусов те растения, которые размножаются ве­гетативно — клубнями, как картофель, луковицами, как тюльпаны, черенками и прививками, как смородина и яблоня. Это понятно: перевиваемый черенок из поколе­ния в поколение заражается разными вирусами. Убытки от фитовирусов исчисляются миллиардами.

Сравнительно простой способ получения безвирусных, здоровых растений — выращивать их из отдельно сре­занных верхушечных почек, не успевших еще заразить­ся от старых клеток. Здесь с успехом можно применить культуры клеток и тканей. Однако как узнать, здорова клетка или она содержит вирус?

Диагностика фитовирусов разработана хорошо. В принципе она не отличается от обнаружения вирусов человека и животных. Впрыскивая кролику фитовирус, можно получить антитело на оболочечный антиген виру­са. Антисыворотка на вирус — хороший, весьма чув­ствительный индикатор присутствия вируса в клеточ­ном соке испытуемого растения. Современные методы иммунодиагностики с применением изотопов позволяют обнаружить вирус, если его концентрация даже менее 0,1 мкг/ мл.

Чтобы получить антитела к фитовирусу, надо иметь его оболочечные антигены, т. е. выделять вирус в боль­ших количествах. Тут и приходит на помощь генная инженерия. Ведь целый вирус нам не нужен, требуется лишь его оболочечный белок — антиген. Ген этого бел­ка можно вставить в плазмиду и размножить в бакте­рии. Этот путь выгоднее, чем наращивать вирус в боль­ных растениях граммами. Первые успехи уже имеются: в МГУ и Институте молекулярной биологии АН СССР клонированы ДНК-копии ряда генов вирусов картофе­ля. (Напомним, что эти вирусы содержат РНК; чтобы вставить их в геном бактерии, нужно получить кДНК ревертазой.) Так получают антигены. А для получения антител очень перспективны гибридомы, о которых мы уже говорили.

Кроме иммунодиагностики есть и другие методы об­наружения вирусов. РКН или кДНК вируса можно пря­мо гибридизовать с денатурированной ДНК, выделенной из клетки растения. Такие методы успешно разра­батываются в МГУ, в лаборатории И. Г. Атабекова.

Что нам может дать безвирусное растениеводство? Возьмем для примера картофель. Урожайность безви­русного картофеля в 2 раза выше обычного (200 ц/га вместо средних 100 ц/га), а такая рассада вполне оку­пает расходы. Следовательно, можно, не снижая объема продукции, вдвое сократить площади под картофель, использовать под него рыхлые почвы, пригодные для кар­тофелеуборочных комбайнов. Если перевести на без­вирусность еще и культуры плодовых и ягодных расте­ний, сахарной свеклы, винограда, хмеля, цитрусовых, то можно будет сказать, что получение безвирусных ра­стений — самое важное из того, что дало культивиро­вание клеток.

Безвирусное растениеводство нельзя свести к вре­менной кампании, пока все вирусы не исчезнут с лица Земли. Этого придется ждать бесконечно долго: ведь многие фитовирусы поражают и культурные, и дикие растения-сорняки, а переносят их насекомые и клещи. Поэтому наряду с получением безвирусных растений ге­нетики и генные инженеры работают над выведением новых сортов, вообще устойчивых к вирусам. Есть идея вставить в геномы растений гены интерферонов живот­ных. Первые опыты в этом направлении уже ведутся.

Речь идет не только об интерферонах! Бельгийским ученым удалось вставить в геном табака ген токсина ба­циллы Бациллюс турингиензис, ядовитого для насеко­мых. В результате табак приобрел устойчивость к на­секомым-вредителям. Значит, в будущем можно будет обойтись без инсектицидов, опасных для человека.

Азотные удобрения и сельское хозяйство. Достиже­ния генной инженерии можно показать еще на одном очень ярком примере. В сельском хозяйстве таким при­мером может быть проблема фиксации атмосферного азота.

Каждая клетка человеческого организма для того, чтобы синтезировать белки, требует определенного на­бора готовых аминокислот. Их источником служит ра­стительная и животная пища. Большинство растений синтезируют свои аминокислоты из простейших азотис­тых соединений — солей аммония и азотной кислоты, содержащихся в почве, на которой они растут. Без под­ходящего источника азота развитие растений становится невозможным, а без растений была бы невозможной жизнь животных и человека.

Человек издревле использовал азотистые удобрения, стараясь повысить урожайность сельскохозяйственных растений. До середины XIX в. это были природные удобрения, в которых необходимые для растений азо­тистые вещества образуются главным образом благо­даря разложению микроорганизмами остатков расти­тельного и животного материала. В бескислородных условиях бактерии-анаэробы сбраживают органиче­ские вещества, и азот освобождается в виде аммиака и аминов; в кислородной атмосфере другие бактерии — аэробные — окисляют амины до аммиака. Часть его улетучивается, другая окисляется дальше с образова­нием селитр — калиевой и натриевой солей азотной кислоты.

Селитры — прекрасное азотное удобрение, но до XIX в. в Европе для этой цели их не применяли, потому что селитряных месторождений на территории Европы с ее дождливым климатом практически нет. Ведь нитра­ты легкорастворимы и вымываются из почвы быстрее, чем накапливаются. Но калиевая селитра — главный компонент дымного пороха, без которого немыслима была война. Селитру для пороха добывали, промывая землю из овчарен и хлевов, могильных склепов, погребов и пещер, населенных летучими мышами, — словом, из тех защищенных от дождя мест, где в почве много органических веществ.

Вот почему в Европе широкую известность приобре­ло открытие в Чили на побережье Тихого океана и при­легающих островах огромных залежей гуаноокаменев­шего помета морских птиц, более чем наполовину состоя­щего из натриевой и калиевой селитр. Дожди в этих краях идут не каждый год и нитраты не вымываются. Древние инки с незапамятных времен задолго до при­хода испанцев использовали гуано как удобрение, по­лучая с его помощью богатейшие урожаи кукурузы.

Европейцы стали выделять из гуано калиевую селитру для пороха. В этом была трудность: ведь в этой породе значительно больше натриевой селитры, которая жадно впитывает влагу из воздуха, расплы­вается и для пороха не годится. Но изобилие гуано окупало трудности по выделению «индийской селитры» (напомним, что из-за ошибки Колумба Америку долго называли Вест-Индией). Индийская, или, как теперь ее называют, чилийская, селитра была важнейшим стратегическим сырьем. Поэтому блокада молодой французской республики в 1793 г. поставила яко­бинскую революцию перед катастрофой: ведь для рес­публиканской армии требовалось семнадцать миллио­нов фунтов селитры в год! Республиканскую, а впос­ледствии и наполеоновскую армии спасли от пораже­ния ученые Г. Монж и К. Бертоле, возродившие ста­рые способы добычи селитры из почв, богатых органи­кой.

В конце XIX в. интенсивное сельское хозяйство в Ев­ропе было немыслимо без чилийской селитры. Но запа­сы ее были не бесконечны. Пессимисты уже предсказы­вали истощение запасов, падение урожаев и голод. А ведь немало селитры шло и на нужды развивающей­ся химической промышленности, в первую очередь на по­лучение азотной кислоты. Сама по себе селитра с появ­лением бездымного пороха добавлялась лишь в быстро-сгорающие его сорта (пушечный порох). Но азотная кислота оказалась незаменимым сырьем при получении как нитроцеллюлозного пороха, так и практически всех взрывчаток (нитроглицерин и тринитротолуол, мелинит и др.). Однако потребность в азотных удобрениях пере­крывала все прочие нужды.

Интересно, что над каждым гектаром посевов, стра­дающих от недостатка азотистой пищи, находились практически неисчерпаемые запасы азота, потенциаль­но способные снабжать эти посевы в течение многих миллионов лет. Действительно, в атмосфере Земли, на 78% состоящей из азота, содержится около 4•1015 т этого драгоценного элемента. Над каждым гектаром почвы на нашей планете поднимается столб воздуха, содержащий 80 тыс. т азота!

Однако ни одно высшее зеленое растение на Земле неспособно само по себе превратить этот азот в асиммилированную форму. Перед химиками встала задача раз­работки промышленного способа фиксации азота ат­мосферы и превращения его в производные аммиака и азотной кислоты. Теория подсказывала, что выгоднее всего связывать азот с водородом, получая аммиак. Со­ли аммония и раствор аммиака в воде сами по себе хорошее удобрение, а окисляя NH3, можно получать и селитру.

Впервые процесс получения аммиака путем вос­становления азота воздуха водородом N2+3H2 = 2NH3

разработал в 1904—1907 гг. немецкий химик Ф. Габер. Метод Габера реализовал в производстве в 1913 г. инженер К. Бош.

Метод Габера—Боша лег в основу современной промышленности азотных удобрений. Получающийся на первом этапе из азота воздуха аммиак может быть превращен в селитру, мочевину и другие формы, усвояе­мые растениями.

Казалось, что проблема азотных удобрений решена. Ведь запасы азота в атмосфере неисчерпаемы. Водород для производства аммиака получают в результате про­стого и эффективного процесса — конверсии природного газа (метана), запасы которого также еще недавно ка­зались неисчерпаемыми:

CH4+H2O = CQ + 3H2

СО+Н2О = СО22

Правда, молекула атмосферного азота (N2) — крепкий «орешек». Само восстановление азота водородом прихо­дится вести в довольно жестких условиях — при темпе­ратуре 450—550°С и давлении 300 атмосфер. И даже эти температура и давление оказались бы недостаточными, если бы не предложенный Ф. Габером катализатор, уско­ряющий реакцию, — губчатое железо с добавками окис­лов калия и алюминия. Катализатор делал энергоемкий процесс связывания азота выгодным до тех пор, пока цены на нефть были низкими.

Однако неумеренное применение азотных удобрений вызвало к жизни новую серьезную проблему. Их эффек­тивность оказалась неожиданно низкой. Вспомним, что нитраты легкорастворимы. Как правило, не меньше поло­вины внесенных в почву селитр вымывается дождями и накапливается в водоемах. Это приводит к «цветению» прудов и озер: в них бурно развиваются микроскопи­ческие водоросли, отчего вода становится похожей на зеленые щи. Рыба в таких прудах гибнет. К тому же соли азотной кислоты в высоких концентрациях канцерогенны. С незапамятных времен в колбасы и ветчину добавляли селитру для того, чтобы мясо обрело красивый розовый цвет. Теперь такие добавки категорически запрещены. Кроме того, химические удобрения влияют отрицательно на сообщества почвенных микроорганизмов и в конечном счете вызывают эрозию почв и снижение плодородия. Однако все эти неприятности оказались мелкими в срав­нении с тем, что произошло в последние годы.

В 1970-х годах по всем капиталистическим странам прокатился энергетический кризис, отразившийся на всей мировой экономике. Цены на нефть и природный газ фантастически возросли, а это нанесло тяжелый удар по всем энергоемким производствам. Фиксация атмо­сферного азота относится к этой категории. Возросшая цена на удобрения немедленно отразилась на ценах пи­щевых продуктов.

Проблема интенсификации сельского хозяйства стала главной проблемой, стоящей перед человечеством. И не­маловажную роль в ней играет расширение производ­ства связанного азота.

Следует сказать, что после Ф. Габера и К. Боша химики не прекратили поиски более дешевых способов фиксации атмосферного азота. Не так давно советские химики М. Е. Вольпин, Б. В. Шур, А. Б. Шилов и их со­трудники открыли новые реакции молекулярного азота с комплексными соединениями переходных металлов, таких, как железо, молибден, титан, ванадий, хром. Есть надежда с помощью этих реакций превращать азот в усваиваемые растениями соединения при низких темпе­ратурах и давлениях. А это резко снизит энергетические затраты. Но этот путь не единственный. Настало время вспомнить о том, что, как бы ни было велико количество вносимого в почву фиксированного химиками азота (бо­лее 400 млн. т в год во всем мире), оно составляет менее трети от того количества азота, которое связывается в природе естественным путем, т. е. живыми микроорганиз­мами почвы и водоемов. Рассмотрим проблему биологи­ческой фиксации азота.

Как микроорганизмы фиксируют атмосферный азот. Земледельцы давно знали, что бобовые растения не толь­ко не нуждаются в азотных удобрениях, но и обогащают почву азотом. Этот факт был установлен до открытия самого азота. Еще в Древнем Риме рачительные хозяе­ва использовали севообороты бобовых с другими куль­турами. Наши крестьяне также издавна предпочитали сеять рожь и лен на клеверищах. Но причина благодат­ного воздействия бобовых на плодородие оставалась за­гадкой. И только в XIX в. ученые установили, что азот из атмосферы связывают не сами бобовые, а микроор­ганизмы, образующие на их корнях клубеньки. Эти микроорганизмы — крупные палочковидные бактерии — впервые обнаружил в 1866 г. русский биолог М. Воро­нин, и лишь 22 года спустя М. Бейеринк сумел выделить их в чистом виде и вырастить в культуре.

Эти бактерии, получившие название Ризобиум, оказа­лись капризными. В культуре они азот не связывали. Лишь в последнее время удалось установить, что Ризо­биум начинает фиксировать азот, преобразуя его в ам­миак, только при наличии определенных веществ — источников энергии — и при низком давлении кислоро­да. В клубеньках на корнях бобовых им кислород не стра­шен. Микробиологи выделили много чистых культур — штаммов Ризобиума. При этом оказалось, что Ризобиум гороха не образует клубеньки, например, у люпина и, наоборот, люпиновый не годится для гороха, но годится для бобов и чечевицы. Эти бактерии встречаются в почве относительно редко (менее 10 клеток на 1 г почвы), но бобовые стимулируют их развитие до 10 млн. на 1 г! Значит, выгода от сожительства высшего растения с бактерией обоюдная. Такие взаимоотношения, как вы знаете, называются симбиозом.

Оказалось, что клубеньковые бактерии-симбионты встречаются не только у бобовых. В последнее время открыто уже более 10 родов небобовых растений с азот­фиксирующими клубеньками на корнях. К ним относятся, например, всем известные ольха, облепиха и лох. За иск­лючением одного рода, симбионты у них не относятся к роду Ризобиум, а более напоминают другую группу микроорганизмов — актиномицетов, известных как про­дуценты антибиотиков.

Однако растений, не способных получать связанный азот от симбионтов, все же несравненно больше. Откуда же они его берут? Ведь не везде же растут бобовые рас­тения. На этот вопрос ответил в 1894 г. наш замечатель­ный микробиолог С. Н. Виноградский, разработавший изящный прием выращивания бактерий на твердой среде без азота. Мы уже упоминали об этом, когда писали о селективных средах. Обычно микробиологи выращива­ют колонии бактерий на поверхности желатины или ага­ра. Но эти вещества содержат связанный азот. С. Н. Ви­ноградский использовал для своих культур гель (сту­день) кремневой кислоты, проще говоря, затвердевший силикатный клей с добавкой Сахаров и солей. Тем самым любая колония, выросшая на этой среде, оказывалась азотфиксирующей: ведь азот она могла получать только из воздуха. Так С. Н. Виноградский открыл первую свободноживущую бактерию, способную связывать азот. Она оказалась анаэробной, живущей без кислорода, и получила название клостридиум Пастера. Род Клостри­диум хорошо известен; к нему относятся, например, возбудители опаснейших заболеваний — столбняка и га­зовой гангрены.

С. Н. Виноградский сделал еще одно важное откры­тие. Ему удалось показать, что происходящее в почве окисление аммиака в нитриты (соли HNO2) и нитраты (соли HNO3) не чисто химический процесс. Селитры в природе возникают в результате жизнедеятельности осо­бых нитрифицирующих бактерий. Одна из них, Нитро­зомонас, окисляет ион аммония в ион нитрита (NO2), а другая — Нитробактер — превращает нитрит в нитрат (NO3). Для них реакции окисления — источник энергии. Похоже, без бактерий не обходится ни один этап превращения азота во все связанные формы.

В первом году нашего века М. Бейеринк открыл еще одного микроскопического фиксатора атмосферного азота, на этот раз аэробного, дышащего кислородом. Бактерия получила название Азотобактер. Она обога­щает азотом почвы умеренного пояса. Позже выясни­лось, что в кислых почвах тропиков ту же функцию вы­полняет другой близкий род, названный в честь М. Бей-еринка — Бейеринкия.

Теперь известно немало свободноживущих микро­организмов — фиксаторов атмосферного азота. Пожа­луй, наиболее интересна из них бактерия Клебсиелла. Это близкий родственник кишечной палочки Эшерихии коли, обитающей в кишечнике каждого из нас. Кишеч­ная палочка — один из наиболее изученных организмов на Земле. Поэтому близкая к ней Клебсиелла оказала неоценимую услугу в изучении тонких деталей меха­низма биологической фиксации азота.

М. Бейеринк открыл еще целую группу азотфиксато­ров, так называемые сине-зеленые водоросли. Строго говоря, это не водоросли, а одна из ветвей бактерий. Правильнее их называть цианобактериями или цианофи­тами.

В нитчатых колониях цианобактерий встречаются своеобразные клетки, практически не содержащие фото­синтезирующего пигмента. Они прозрачны и имеют тол­стую двухслойную оболочку — гетероцисты. Назначение гетероцист долгое время оставалось неясным, однако ученые подметили, что связывают азот только те сине-зеленые, которые образуют эти специализированные клетки. Согласно последним данным плодородие почвы обеспечивают наряду с клубеньковыми бактериями и цианобактерии, причем роль последних иногда оказыва­ется важнее.

Некоторые цианобактерии также вступают в симбиоз с другими организмами. Вы знаете, что лишайник — симбиоз гриба и водоросли. У многих лишайников эта «водоросль» сине-зеленая, способная фиксировать азот. Поэтому они могут расти даже на оконном стекле.

Другие цианобактерии — симбионты древних тропи­ческих растений — цикадовых (тех, что неправильно называют саговыми пальмами). Агрохимиков давно за­нимал интересный факт. Рисовые заливные поля Юж­ной Азии при чрезвычайно интенсивной системе хо­зяйства не снижают плодородия, хотя о селитре там и не слыхали. Оказалось, что рис снабжают азотом сине-зеленые, в первую очередь симбионты крошечного во­дяного папоротника Азоллы. Азоллу во Вьетнаме уси­ленно изучают; это растение, возможно, будет компо­нентом искусственных экологических циклов в косми­ческих кораблях. Во всяком случае, оно уже побывало в космосе вместе с В. В. Горбатко и Фам Туаном.

Итак, азотфиксаторов, как симбиотических, так и свободноживущих, к настоящему времени описано уже немало. Но все они относятся к прокариотам — организ­мам без оформленного ядра. Эукариоты — высшие рас­тения, грибы, животные усваивать атмосферный азот оказались неспособными.

Выдающийся вклад в разгадку тайны фиксации ат­мосферного азота внесли русские и советские ученые. Еще в 1920-х годах С. П. Костычев доказал, что в основе биологического связывания азота (N2) лежит процесс восстановления его «активированным водородом орга­нического вещества». Иными словами, в живых клетках азотфиксаторов осуществляется тот же процесс, что и в установках Габера — Боша, но при низкой температуре и атмосферном давлении!

В чем тут разгадка? Вспомните, что и 500°С температуры, и 300 атмосфер давления еще недостаточны для синтеза аммиака по Габеру и приходится прибегать к катализатору — веществу, ускоряющему химическую реакцию.

С. Н. Виноградский в 1932 г. пришел к выводу, что реакция биологической фиксации азота ускоряется на­столько, что становится возможной и выгодной в усло­виях, совместимых с жизнью, особым ферментом, кото­рый он назвал нитрогеназой.

К середине 1950-х годов было доказано, что все микроорганизмы, способные фиксировать азот атмосфе­ры, содержат фермент нитрогеназу, который катализи­рует восстановление N2 в конечном итоге до NH4+. С это­го момента основные усилия ученых сконцентрировались на изучении строения, механизма действия, регуляции активности и регуляции биосинтеза нитрогеназы.

Волшебная нитрогеназа. Фермент нитрогеназа — очень сложный белок. Он слагается из двух частей, по­лучивших название компонент I и II. Компонент I, имею­щий молекулярную массу 220 000, содержит от 28 до 34 атомов железа и 2 атома молибдена, поэтому его называют FeMo-белком. Компонент II меньше (моле­кулярная масса 60 000) и содержит 4 атома железа. Его называют Fe-белком. Оба белка содержат также большое количество серы в виде сульфидов. Эти неорга­нические добавки наводят на размышления. Вспомним, что в реакциях связывания азота, изучаемых М. Е. Вольпиным и А. Б. Шиловым, участвуют комплексные соеди­нения металлов, в том числе железа и молибдена. Не пы­таются ли химики-биоорганики заново создать механизм, уже реализованный природой в живых клетках азотфиксаторов?

Компоненты I и II также сложные образования. Они состоят из более мелких субъединиц, причем каждая субъединица сложена одной полипептидной цепью и ко­дируется своим геном. FeMo-белок состоит из двух субъ­единиц одного сорта (их назвали α-субъединицами) и двух — другого (β-субъединицы). Структуру его можно написать сокращенно α 2 β 2– Fe-белок проще, его структура α 2, т. е. он состоит из двух одинаковых цепочек амино­кислот (рис. 44).

Схема работы нитрогеназы

Схема работы нитрогеназы

Замечательно, что нитрогеназы, изолированные из любого микроорганизма, фиксирующего азот атмосферы, построены практически одинаково. Субъединицы этих белков довольно сходны и по аминокислотной последо­вательности. Не удивительно поэтому, что активная нит­рогеназа может быть построена из компонента I, вы­деленного из одного микроорганизма (например, Клебси­еллы), и компонента II, полученного из совсем другого источника (например, азотобактера).

Получение таких молекул-химер свидетельствует о многом. В первую очередь о том, что механизм биоло­гической фиксации азота очень консервативен и возник в глубокой древности, когда первичные организмы ис­черпали весь связанный азот на поверхности Земли и столкнулись с проблемой азотного голодания. С тех пор этот механизм в своих общих чертах практически не ме­нялся.

Собственно восстановлением азота в аммиак занима­ется FeMo-белок. Расчеты показывают, что эта реакция должна идти в несколько стадий с образованием про­межуточных продуктов, нам еще не известных. На схеме в качестве промежуточного соединения показан гидрид азота — это вполне вероятно, но еще не доказано.

Заметьте также, что, восстанавливая азот, FeMo-белок отдает электроны ионам водорода (протонам), пре­вращая их в газообразный водород. Эта важная побоч­ная реакция, катализируемая нитрогеназой, также может найти практическое применение. Ведь водород называют топливом будущего.

Задача Fe-белка, по-видимому, сводится к тому, чтобы поставлять электроны FeMo-белку. Поэтому ком­понент II часто называют белком-восстановителем или редуктазой.

Нитрогеназа способна катализировать реакцию пре­вращения (восстановления) ацетилена в этилен:

НС = СН Н2 (—>) Н2С=СН2

Это объясняется, видимо, сходством связей между атомами углерода в молекуле ацетилена и атомами азо­та в его молекуле

N=N

Вряд ли в природе этот процесс происходит, но для определения активности фермента реакция восстанов­ления ацетилена оказалась очень удобной. Ацетилен хорошо растворяется в воде, а этилен плохо, поэтому легко можно отделить продукт реакции от исходного вещества и определить его количество. Теперь такие из­мерения проводятся даже в полевых условиях.

Как и все ферменты, нитрогеназа, несмотря на свои чудесные свойства, не может совершить невозможного: для биологического синтеза NH3 из N2 требуется энер­гия, львиная доля которой идет на разрыв связей в моле­куле азота. Эти энергетические затраты покрываются за счет гидролиза универсального источника энергии клет­ки — аденозинтрифосфата (АТФ). К этой важной сто­роне мы еще вернемся.

Кроме нитрогеназы, в биологическом синтезе аммиа­ка участвуют и другие белки. Все они наряду с полипеп­тидами, слагающими FeMo- и Fe-белки, кодируются определенными генами. Эти гены называют nif-генами (от первых букв слов нитогенфиксация). Мы уже упо­минали, что способностью связывать азот обладает и близкий родственник кишечной палочки — Клебсиелла. Ее генетический аппарат детально изучен. У Клебсиеллы оказалось 17nif-генов. Они объединены в 7 групп, имену­емых nif-оперонами. Продукт деятельности каждого опе­рона — соответствующая иРНК, на которой синтезиру­ется белок. nif-Опероны разбросаны по единственной хромосоме бактерии; между ними встроены гены, не име­ющие отношения к фиксации азота.

Функции многих продуктов nif-генов сейчас известны. Так, гены nif К и nif D кодируют полипептидные цепи белков — предшественников субъединиц FeMo-белка. Гены nif В, nif N и nif E кодируют белки, которые пре­вращают эти предшественники в нормальные α- и β-субъ­единицы компонента I. Белки — продукты генов nif A и nif L — заняты регуляцией активности нитрогеназы в клетке и т. д. Процесс регуляции эктивности nif-генов очень сложный. Так, у Клебсиеллы найдены еще три гена, не входящие в состав nif-оперона (их назвали ntr А, В и С), продукты которых регулируют активность nif А- и nif L-белков. Иными словами, они работают как регуляторы активности регуляторов.

Генетики научились «вырезать» отдельные nif-гены или целые nif-опероны из хромосомы Клебсиеллы, а так­же у некоторых других микроорганизмов и переносить их в хромосомы других бактерий. В клетках кишечной палочки (которая неспособна фиксировать N2) ученым даже удалось заставить на короткое время заработать нитрогеназу Клебсиеллы. А в клетках азотобактера нит­рогеназа Клебсиеллы чувствовала себя совсем хорошо и работала в аэробных условиях (напомним, что сама Клебсиелла — анаэроб). Правда, перенос всех 17 nif-ге­нов из Клебсиеллы в клетки дрожжей — простейших эукариотов — не привел к синтезу аммиака.

Располагая отдельными nif-генами Клебсиеллы, ге­нетики сумели также определить, как эти гены органи­зованы в хромосомах других микроорганизмов, фикси­рующих азот атмосферы. При этом обнаружился инте­ресный и практически важный факт: у Ризобиум — мик­роорганизмов, населяющих клубеньки на корнях бобо­вых растений, — nif-опероны находятся не в хромосоме, а в составе специальных крупных плазмид. В принципе можно выделять эти плазмиды и вставлять в клетки микроорганизмов, не способных к фиксации азота!

Как перенести ген в клетку растения. Возникает воп­рос: если известен белок, отвечающий за фиксацию азо­та атмосферы, если генетики получили гены, кодирую­щие составляющие этого белка, то почему не перенести эти гены в клетки зеленых растений?

Прежде чем ответить на этот вопрос, мы должны задать другой вопрос: а существуют ли векторы — плазмиды или вирусы, которые позволят перенести чуже­родную ДНК в клетки растений? Ведь растительная клетка и по структуре клеточных стенок, и по своему внутреннему устройству так сильно отличается от бакте­риальной, что для нее вряд ли подойдут известные бак­териальные векторы, о которых мы рассказали в пред­шествующих главах. Если же вирусов или плазмид, при­годных для переноса генов в растительную клетку, не найдется, сам вопрос о генной инженерии у растений отпадает.

Но и здесь все складывается, казалось бы, как нель­зя лучше. Оказалось, что бактерии Агробактериум туме­фациенс, обладающие давно известным свойством вы­зывать опухоли (так называемые галлы) у многих расте­ний, содержат плазмиды, которые специально приспо­соблены к переносу генов из бактериальной в раститель­ную клетку. Именно в этих плазмидах закодированы бел­ки, вызывающие трансформацию нормальных клеток растений в раковые. Их называют Ti-плазмидами (Ti — tumor induciug), индуцирующими опухоли.

Обычно нормальное развитие растительной клетки регулируется специальными гормонами, так же как и развитие животной клетки. О гормонах роста животных мы уже говорили раньше. Естественно, фитогормоны имеют совсем другое химическое строение, чем сомато­тропин, соматостатин и другие гормоны животных. Одна­ко функции их сходны: и те и другие стимулируют рост, развитие и специализацию одних клеток и подавляют те же процессы у других. Белки, закодированные в Ti-плазмидах, нарушают такую гормональную регуляцию, и клетки растений начинают расти бесконтрольно. Ti-плаз­миды имеют очень большие размеры — около 200 тыс. пар оснований. Однако они содержат сравнительно не­большую область (13 тыс. пар оснований) так назы­ваемой Т-ДНК, которая встраивается в хромосому рас­тительной клетки, стабильно сохраняется и функциони­рует в ней. Таким образом, гены, встроенные в Т-ДНК, хотя и имеют бактериальное происхождение, но уже снабжены всеми необходимыми «сигналами», обеспечи­вающими их работу в растительной клетке. Если встро­ить nif-гены в Т-ДНК Ti-плазмиды, то теоретически мож­но получить на растениях полезные галлы, которые бу­дут фиксировать азот атмосферы. Такие галлы будут на­поминать клубеньки на корнях бобовых растений, которые, кстати, также относятся к растительным опухолям — галлам (рис. 45).

Схема получения рекомбинантного высшего растения с помощью Ti-плазмиды...

Схема получения рекомбинантного высшего растения с помощью Ti-плазмиды…

Из Ti-плазмиды генные инженеры уже создали удоб­ные векторные системы для переноса чужеродных генов сначала в клетки Агробактериум, а затем с помощью этой бактерии (и второй специально сконструированной плазмиды, заранее помещенной в клетки Агробактери­ум) включили чужеродные гены в геном растения. Такие векторы называют бинарными (двойными), потому что они работают в паре — показано на рисунке. Обратите внимание на то, что вектор, в который встраивается чу­жеродный ген, — это типичный челночный вектор, т. е. он может реплицироваться как в бактериальной, так и в растительной клетке.

Бинарная векторная система с успехом использова­на для переноса в клетки растений признака устойчи­вости к антибиотику канамицину (для многих растений он ядовит). С ее помощью получены светящиеся листья табака после того, как в геном этого растения включи­ли ген белка люциферазы, выделенный из светлячков. Ген люциферазы в генетической инженерии растений надеются использовать как маркер, подобно тому как ген 8-галактозидазы (помните голубые колонии?) ис­пользуют в генной инженерии микроорганизмов.

Существуют и другие способы направленного пере­носа в растительную клетку чужеродной ДНК. Мы писа­ли, что недавно были открыты ДНК-содержащие виру­сы растений. Это открытие сначала показалось удиви­тельным: ведь большинство растительных вирусов со­держат не ДНК, а РНК. Если генетическим путем пре­вратить эти вирусы в непатогенные (т. е. сделать их без­вредными) для растения, то они могут оказаться под­ходящими векторами для nif-генов.

Что мешает создать азотфиксирующее растение? К сожалению, на пути конструирования новых видов растений, фиксирующих азот атмосферы без помощи микроорганизмов, стоят очень серьезные трудности. Первая трудность состоит в том, что в растительной и бактериальной клетках действуют совершенно различ­ные механизмы регуляции активности генов. Иными сло­вами, процессы транскрипции (синтез РНК на ДНК) и трансляции (синтез белка) у прокариот и эукариот управляются различными сигнальными последователь­ностями генов и различными белками. Выход здесь подсказывает изучение генома хлоропластов. Как вы знае­те, хлоропласты — это обособленные органеллы расти­тельных клеток, осуществляющие процесс фотосинтеза. Хлоропласты имеют собственный геном достаточно боль­шого размера (от 80 до 200 тыс. пар оснований). Есть обоснованная гипотеза о том, что хлоропласты проис­ходят от симбиотических микроорганизмов — фотосин­тетиков (ближе всего к ним сине-зеленые, цианофиты). Генная инженерия эту гипотезу подтвердила. Структу­ра генов, составляющих этот геном, хорошо изучена у многих растений. А для табака известна нуклеотидная последовательность всего генома хлоропластов (око­ло 150 тыс. пар оснований). Анализируя строение этих генов, молекулярные биологи обнаружили в них те же сигналы транскрипции (промоторы и терминаторы) и трансляции, что и у генов бактерий. Более того, хлоро­пластный ген очень важного фермента — карбоксилазы (о котором мы подробнее расскажем позже) — активно работал после того, как его перенесли в клетки кишеч­ной палочки.

Следовательно, хлоропласты — это прекрасное по­мещение для nif- и ntr-генов бактерий. Кстати, генные инженеры сейчас интенсивно работают над конструиро­ванием из хлоропластной ДНК векторов, которые и поз­волят переносить чужеродные (например, бактериаль­ные) гены непосредственно в хлоропласты. Здесь, прав­да, возникает новая трудность: ведь в хлоропластах в результате фотосинтеза возникает свободный кислород, а кислород и работающая нитрогеназа несовместимы.

О другой проблеме мы уже рассказывали: биоло­гическая фиксация азота подобно химической требует огромных энергетических затрат. В клетке эти расходы в конечном итоге покрываются за счет гидролиза АТФ. При отщеплении от АТФ одной молекулы Н3РО4 обра­зуется адениндифосфат и выделяется энергия, потреб­ляемая клеткой. Так, Клебсиелла расходует по разным оценкам от 12—14 до 29 молекул АТФ на превращение одной молекулы N2 в ионы аммония. А если учесть, что при работе нитрогеназы ее компонент II (Fe-белок) по­лучает электроны от таких биологических восстанови­телей, как ферродоксин и флаводоксин, то на биологиче­скую фиксацию одного моля N2 этим организмом расхо­дуется до 40 эквивалентов АТФ. Значит, если в клетку растения или какого-то другого организма, не приспособленного природой для фиксации азота атмосферы, просто ввести нитрогеназу и заставить ее работать, то это мгновенно исказит ее энергетический обмен, и клет­ка погибнет от аденозинтрифосфатного голода. Клетка попросту надорвется, как человек, под непосильным грузом.

Еще одна, пожалуй, более серьезная трудность за­ключена в свойствах самой нитрогеназы. Если этот фер­мент изолировать из фиксирующего азот микроорга­низма, то он мгновенно инактивируется, «отравляется» кислородом воздуха. Причем водород отравляет нитро­геназу необратимо, т. е. если фермент вновь поместить в бескислородную среду, то он остается неактивным. Из этого следует, что процесс биологической фиксации азота возник, когда земная атмосфера еще не содержа­ла кислорода. Населявшие Землю микроорганизмы были анаэробами и получали энергию за счет реакций, схожих с современным брожением, а фотосинтезирующие бактерии усваивали сероводород. Со временем си­не-зеленые выработали способность при помощи солнеч­ного света расщеплять воду и получать углеводы из об­разующегося при этом водорода и углекислого газа (СО2). Запасы водорода в воде оказались неисчерпае­мыми, но при этом выделялся вредный побочный про­дукт… кислород, абсолютно ядовитый для всех тогда живущих существ! Это потом кислород стал живитель­ным газом, когда возникло кислородное дыхание. Но все черты фиксации азота менять было уже поздно. У тех организмов, которые возникли позже, т. е. у живот­ных и растений, этот процесс вообще не возник, а микро-организмы-азотфиксаторы выработали сложные меха­низмы, защищающие нитрогеназу от кислородного отрав­ления. Следовательно, если мы перенесем nif-гены в клетки, которые не умеют защищать нитрогеназу от кис­лорода, то в лучшем случае мы получим неактивный фер­мент, а в большинстве случаев такая клетка быстро пре­кратит синтез ненужного ей белка.

И наконец, еще одна трудность, с которой встрети­лись генетики, конструирующие новые фиксирующие азот организмы, состоит в том, что ионы аммония, об­разующиеся при восстановлении азота, должны сразу же использоваться другими ферментативными системами для синтеза аминокислот. Если же они накапливаются в клетке в слишком больших количествах, то биосинтез нитрогеназы (правда, на этот раз обратимо) подавляет­ся. Этот механизм позволяет клеткам многих фиксиру­ющих азот микроорганизмов связывать ровно столько атмосферного азота, сколько им необходимо для внут­ренних нужд. Продукт реакции, накопленный в доста­точном количестве, быстро останавливает ее; поэтому ионов аммония в клетке всегда столько, сколько необ­ходимо и достаточно. Ясно, что для сверхпродукции «связанного азота» клетки с такой системой регуляции не годятся. Эту последнюю трудность удалось преодо­леть сравнительно легко.

Советский генетик С. В. Шестаков получил мутанты цианобактерий, которые выбрасывают все избыточные ионы аммония из цитоплазмы клеток в среду. Кроме то­го, у этих мутантов нарушена система, ответственная за подавление биосинтеза нитрогеназы ионами аммония. О получении подобных мутантов азотбактера сообщи­ли недавно американские генетики. Такие мутантные микроорганизмы уже сами по себе могут оказаться очень полезными как сверхпродуценты асиммилируемого азо­та. Кроме того, они помогут выявить тот ген, который необходимо выключать, чтобы клетка могла бесконтроль­но превращать азот в ионы аммония.

Значительно более сложными оказались проблемы энергетики фиксации азота и защиты нитрогеназы от отравления кислородом. Тем более что эти процессы про­тиворечиво связаны. Чтобы получить достаточное коли­чество АТФ для энергоемкого процесса фиксации азота, клетке надо дышать кислородом (бескислородный син­тез АТФ — брожение — дает энергию примерно в 18 раз меньше). Но тот же кислород отравит нитрогеназу. Вставлять nif-гены в клетку с кислородным дыханием — все равно что разводить рыб на суше.

Каким же путем все-таки можно снизить расход энер­гии при превращении N2 в NH3, катализируемом нитро­геназой? Одно направление работ подсказывает рас­смотренный нами механизм работы этого фермента. Да­вайте еще раз вернемся к рисунку. Как мы видим, зна­чительная доля электронов (а следовательно, и значи­тельная доля энергетических ресурсов в виде молекул АТФ) расходуется на восстановление ионов водорода — протонов (Н+) до молекул водорода. В среднем нитро­геназа расходует две молекулы АТФ на перенос одного электрона. Эта побочная реакция с точки зрения самого процесса фиксации азота есть не что иное, как из­лишняя трата энергии. А что если образующийся моле­кулярный водород снова превратить в протоны и элек­троны: ведь электроны вновь могут быть использованы в нитрогеназной реакции? Клетка осуществляет такое превращение водорода с помощью фермента гидроге­назы. Этот фермент, а также ряд других белков, способ­ствующих превращению газообразного водорода в про­тоны и электроны, закодированы в так называемых hup-генах. Оказывается, что некоторые дикие штаммы Ризобиум уже содержат hup-гены, и урожай бобовых, живующих в симбиозе с такими бактериями, всегда на­много выше, чем у растений, в клубеньках которых бак­терии обычные.

Таким образом, при конструировании новых фикси­рующих азот организмов генетики предполагают наря­ду с nif-генами вводить в клетки hup-гены (гены «за­хвата» молекулярного водорода). Источником таких ге­нов будут скорее всего легкодоступные бактерии из ро­да Псевдомонас, способные расщеплять нефтепродук­ты, у которых hup-гены находятся в составе специаль­ных плазмид (т. е. уже от природы встроены в векторы).

Другой, не менее важный путь преодоления «энерге­тического кризиса», связанного с введением в организм nif-генов, лежит в направленном совершенствовании энер­гетики этого организма.

Известно, что для всех зеленых растений, а также для многих микроорганизмов (сине-зеленых, например) основным источником энергии служит солнечный свет. В результате процесса фотосинтеза с помощью молекул пигмента хлорофилла, главного участника преобразова­ния световой энергии в химическую, из воды и углекис­лого газа образуются углеводы и молекулярный кисло­род. Благодаря фотосинтезу в этих организмах идет так­же образование аденозинтрифосфата и других перенос­чиков энергии.

Оказывается, эффективность фотосинтетической фик­сации СО2 также можно повысить генетическим путем. Ясно, что это перспективно не только для фиксации азо­та, но и для повышения общей продуктивности расте­ния. Дело в том, что фермент карбоксилаза — ключе­вой катализатор фиксации углекислого газа — так же, как и нитрогеназа, наряду с основной полезной реакцией (ведущей к синтезу источников углеводов) катализирует побочную и бесполезную с точки зрения синтеза источ­ников энергии реакцию, которая в конечном итоге при­водит вновь к освобождению СО2. Эту реакцию можно подавить, если, например, выращивать растение в атмо­сфере, обогащенной углекислым газом. Однако изме­нять состав атмосферы, в которой растут сельскохозяй­ственные растения, слишком дорого (это можно делать только в теплицах). Генетики пошли другим путем. Они получили такие мутантные формы фермента карбоксила­зы, которые потеряли способность катализировать по­бочную реакцию и тем самым направили фиксируемый углекислый газ только на синтез углеводов.

Очень интересная возможность в повышении эффек­тивности использования продуктов фотосинтеза заклю­чена в усовершенствовании ферментативных систем «ме­таболизма» воды. Молекулы воды при фотосинтезе слу­жат источником электронов, используемых для образо­вания АТФ. Недавно у цианобактерий удалось найти гены (так называемые lit-гены), в которых закодирова­ны белки, расщепляющие молекулы воды. Генетики на­деются, увеличивая число таких генов в клетках фотосин­тетиков, существенно улучшить их энергетику.

Чему нас могут научить бактерии. Теперь давайте посмотрим, как обстоит дело с защитой нитрогеназы от кислорода у разных фиксирующих азот атмосферы орга­низмов. У таких бактерий, как Клебсиелла, этой пробле­мы вообще не существует. Ведь Клебсиелла усваивает атмосферный азот только тогда, когда она живет в ана­эробных (бескислородных) условиях. Она, как говорят микробиологи, факультативный анаэроб. В присутствии О2 эти бактерии могут расти только на готовых источ­никах азота. Их нитрогеназа при этом не только не рабо­тает, но и не синтезируется. Да и в знаменитом опыте, когда nif-гены из Клебсиеллы заработали в кишечной палочке, эта бактерия фиксировала азот тоже только в анаэробных условиях. Ведь в нашем кишечнике она живет без кислорода, получая энергию благодаря сбра­живанию углеводов. Таким образом, Клебсиелла не мо­жет быть использована для спасения нитрогеназы от кислорода. Азотфиксатор из рода Клостридиум также не может помочь: клостридии — облигатные (обяза­тельные) анаэробы, гибнущие в кислородной среде.

Другое дело цианобактерий. Как вы уже знаете, у цианобактерий, фиксирующих азот атмосферы (например, у анабены, живущей в симбиозе с азоллой — мелким водяным папоротником), наряду с нормальными пигментированными клетками (ведь цианобактерии — это фотосинтетики) имеются присоединенные к ним до­полнительные клетки, названные гетероцистами. Гетеро­цисты возникают у анабены только тогда, когда у них нет для питания другого источника азота, кроме атмос­ферного. Если кормить ее солями аммония или селитрой, то гетероцисты исчезают. У анабены, фиксирующей азот атмосферы, вся нитрогеназа содержится в гетероцис-тах; причем клеточные стенки гетероцистов устроены так, что доступ кислороду в них закрыт. По последним данным, в гетероцистах то небольшое количество кисло­рода, которое вместе с азотом проникает через оболоч­ки, активно связывается особыми реакциями. Все же не­обходимые для работы нитрогеназы источники энергии поступают в гетероцисты из нормальных соседних фото-синтезирующих клеток. Таким образом, гетероцисты — это не что иное, как специализированные фабрики азо­тистого питания, сырьем для которых служит азот атмо­сферы, а энергетическим источником — солнечный свет.

Эффективность гетероцист как защитного средства демонстрируется простым опытом: связывание азота идет и в бесклеточных экстрактах из сине-зеленых, но только в бескислородной среде. При 5% кислорода нит­рогеназа, не защищенная гетероцистами, отравляется за считанные минуты, а ведь в воздухе кислорода в 4 раза больше. Даже 0,1% кислорода заметно подав­ляет синтез иона аммония.

Любопытно, что ископаемые остатки сине-зеленых, содержащих гетероцисты, обнаружены в отложениях возрастом около 2,2 млрд. лет. Более ранние отпечатки цианобактерии гетероцист не имеют. Значит, кислород стал поступать в атмосферу Земли немногим ранее 2 млрд. лет назад; следовательно, и кислородное дыха­ние не может быть старше. Человек, попавший в такую атмосферу, задохнулся бы мгновенно. Значит, если вставлять азотфиксирующие гены в хлоропласты, не­обходимо превратить эти органеллы во что-то вроде гетероцист, но внутриклеточных симбионтов высшего растения. У таких растений будут и нормальные хлоро­пласты, и новые органеллы — «нитропласты».

Замечательная система защиты нитрогеназы вырабо­талась у Ризобиум. Напомним, что этот важнейший фиксатор атмосферного азота живет в симбиозе с бобовы­ми растениями. Ризобиум, проникая в клетки корней бобовых, вызывает на них образование клубеньков. В клубеньках Ризобиум разрастается в своеобразные колонии клеток, окруженные плотным слоем клеток рас­тения. Вот эти растительные клетки и вырабатывают белок, защищающий нитрогеназу от кислорода. Интерес­но, что этот белок оказался аналогом гемоглобина кро­ви — белка — переносчика кислорода у человека и жи­вотных. Поэтому он был назван леггемоглобином (лег от английского legume — бобовые). Гемоглобин крови состоит из двух частей: белковой (глобина) и железо-порфириновой (гема), которая собственно и связывает кислород. Такие же две части синтезируются клетками растений, а железопорфириновая (гем) — клетками Ри­зобиум. Таким образом, растительные клубеньковые клетки растения снабжают клетки Ризобиум глобином, который, соединяясь в них с гемом, образует леггемо­глобин, связывающий главного «врага» нитрогеназы — молекулярный кислород. Поэтому скопления Ризобиум в клубеньках всегда окрашены в красный цвет. Из кле­ток растения в Ризобиум поступают также источники энергии в виде продуктов фотосинтеза (они образуются в листьях растения и затем транспортируются в его кор­невую систему), а Ризобиум питает растение фиксиро­ванным азотом атмосферы. Так выглядит симбиоз расте­ния и микроорганизма на биохимическом уровне.

Многому можно научиться у азотобактера. Он жи­вет не только вне растений, но и в кислородсодержащей среде. Тем не менее его нитрогеназа исправно работает. Происходит это потому, что азотобактер очень интенсив­но дышит и быстро расходует весь кислород, который про­никает в его клетки. Но даже если затруднить дыхание азотобактера, то он не сразу прекращает существова­ние. Его клетки начинают вырабатывать так называе­мый Fe-S-белок, т. е. белок, содержащий железо и серу. Достаточно одной молекуле такого белка связаться с нитрогеназой, чтобы обезопасить ее от кислорода. В комп­лексе с Fe-S-белком нитрогеназа практически не рабо­тает, но зато стоит убрать кислород, и этот белок как активность фермента полностью восстанавливается (вспомним, что незащищенную нитрогеназу кислород отравляет необратимо). Сейчас генетики сумели разо­браться, в каком из генов азотобактера закодирован Fe-S-белок. Этот ген также будет необходим при созда­нии новых организмов, фиксирующих азот атмосферы.

Известно далеко не все о том, какие еще сущест­вуют выработанные природой способы защиты нитроге­назы от кислорода. Так, клубеньковые микроорганизмы, живущие в симбиозе с ольхой, обходятся без леггемогло­бина. Ясно, что какое-то противоядие от кислорода у них есть. Добавим, что пока известны далеко не все биохи­мические фиксаторы азота, в арсенале природы навер­няка имеется их немало.

Теперь, кажется, известно, как спланировать работу по созданию зеленого растения, фиксирующего атмосфер­ный азот без помощи микроорганизмов. Для этого нужно:

— выделить гены азотофиксации из любого фикси­рующего азота атмосферы организма, который заранее превращен в сверхпродуцент NH4 (т. е. организм с де-репрессированным синтезом нитрогеназы);

— перенести их стандартными методами генетической инженерии в Т-ДНК в район Ti-плазмиды;

— перенести в эти же плазмиды гены, кодирующие синтез леггемоглобина, который защитит нитрогеназу от кислорода;

— включить в эти плазмиды гены энергетического обеспечения работы нитрогеназы (hup, lit, а также гены «улучшенной» карбоксилазы);

— трансформировать этими рекомбинантными Ti-плазмидами клетки растения.

К сожалению, время для таких прямых опытов еще не пришло: мы слишком мало знаем о физиологии и генетическом аппарате растительных клеток, чтобы рас­считывать на быстрый успех.

Но ведь проблема увеличения пищевых ресурсов тре­бует немедленного разрешения: уже сейчас сотни мил­лионов людей в слаборазвитых странах страдают от постоянного недостатка белковых продуктов, а по дан­ным ООН на земном шаре каждые 4 секунды от недоеда­ния умирает один ребенок. Поэтому ученые, изучающие биологическую фиксацию азота, направляют усилия на решение более реальных задач.

Во-первых, это конструирование новых фиксирую­щих азот микроорганизмов-фотосинтетиков, которые усваивают атмосферный азот благодаря солнечной энергии. Кроме того, ученые научились превращать их в такие формы, которые выбрасывают все избыточные азотистые соединения в среду. Следовательно, остается создать более продуктивные по синтезу аммиака штаммы этих микроорганизмов.

Основное требование к новым формам азотфиксато­ров — более интенсивная фиксация азота атмосферы при тех же (или даже меньших) затратах энергии. Дикие клубеньковые бактерии можно улучшить, как человек улучшил грибок — продуцент пенициллина, заставив его синтезировать антибиотик в тысячи раз активнее. Вы уже познакомились с тем, каким образом генетики решают подобные задачи: это освобождение нитрогеназы от зависимости концентрации ионов аммония в клетке, введение в клетку генов гидрогеназы, увеличение фото­синтетических возможностей самого растения и т. д. Правда, в реальных полевых условиях «новички» должны сосуществовать с огромным миром микроорганизмов, населяющих почву. А главное, они должны выдерживать борьбу за существование и побеждать в этой борьбе со своими непосредственными родственниками — клубень­ковыми бактериями, которые привыкли жить в симбиозе с растением. Это сложная проблема: ведь высшие куль­турные растения, как правило, оказываются «поби­тыми» дикими сорняками. Вот почему ученые, создавая новые формы микроорганизмов, сразу отбирают те из них, которые способны выдержать конкуренцию с хозяе­вами почвы. В последние годы микробиологи и генетики добились серьезных успехов в повышении урожайности соевых бобов, сконструировав для них новые штаммы Ризобиум. Соя, как известно, — один из основных по­ставщиков полноценного белка сейчас и в ближайшем будущем.

Решая проблему «азотного голода», генетики не только улучшают известные виды азотфиксирующих симбионтов, но и работают над созданием новых почвен­ных микроорганизмов. Дело в том, что, кроме клубень­ковых бактерий, живущих на корнях лишь немногих рас­тений, в ризосфере (так называют корневую систему с прилегающей к ней почвой) любого растения обитает богатейший и специально приспособленный к ней мир микроорганизмов. Некоторые из них живут непосредст­венно на корнях растений, другие — возле них. Ризосферные микробы питаются в значительной мере вы­делениями корней, но и сами снабжают растения полез­ными продуктами своей жизнедеятельности.

К сожалению, в ризосферной микрофлоре очень ма­ло видов, фиксирующих атмосферный азот. Свободно-живущие азотфиксаторы, например азотобактер, по­чему-то предпочитают жить вне ризосферы. Микробио­логи и генетики пытаются сейчас выяснить этот вопрос. Какие особенности генетического аппарата ризосфер­ных бактерий заставляют их из поколения в поколе­ние селиться на корнях высших растений? Кое-что ясно уже сейчас. В состав клеточной стенки бактерий входят специальные сложные углеводы — полисахариды с соста­вом, характерным для каждого определенного вида. Эти специфичные для вида вещества и помогают бактериям «узнать» на стенке клеток, слагающих оболочку корня, специальные места (рецепторы) и приклеиться к ним. Такое взаимное «узнавание» обязательно происходит и у клубеньковых бактерий, и корней бобовых, прежде чем бактерии проникнут внутрь корня. Все это удивительно напоминает «узнавание» антителом своего антигена.

У клубеньковых бактерий гены «узнавания» недавно были найдены в составе плазмид. Это открытие трудно переоценить. Ведь с помощью таких генов можно «при­ручить» к растениям мощные фиксаторы азота, которые чуждаются ризосферы, или приучить ризосферных азотфиксаторов (например, азоспирилл) к другому хозяину. На каждом пути перед исследователями встают труд­ности.

Ризосферные бактерии привыкли жить вместе с дру­гими обитателями корневой системы; поэтому им, навер­ное, легче выстоять в борьбе за существование при сме­не хозяина. В сельском хозяйстве давно применяется препарат «нитрагин» — масса подсушенных клубенько­вых бактерий, которой заражают семена бобовых перед посевом. Ученые надеются на основе новых форм азото­бактера, «прирученного» к специфическим условиям ризосферы, или новых форм азоспирилл создать эффек­тивные биологические азотные удобрения — новые «азобактерин» и «спириллин».

Другой путь: среди постоянных жителей ризосферы полезных сельскохозяйственных растений, например пшеницы, найти такие ризосферные микроорганизмы, ко­торые легко превратить в азотфиксаторов. Для этого нужно перенести в них nif-гены и другие гены, обеспе­чивающие энергетику работы нитрогеназы и защиту это­го фермента от кислорода.

Оптимисты считали, что такие формы ризосферных микроорганизмов будут получены к 1985 г., пессимисты отодвигали этот срок до 1990 г. Как видим, надежды возлагались на ближайшее будущее. В печати появи­лось сообщение, что австралийским ученым удалось вста­вить бактериальные гены в клетки томатов, и теперь растение «может брать необходимый для жизни азот непосредственно из воздуха, не нуждаясь более в мине­ральных удобрениях». Увы, нитрогеназа в клетках тома­та будет бесполезным грузом.

Наш рассказ будет неполным, если не упомянуть еще об одной, на первый взгляд фантастической идее — создать азотфиксирующих животных! Казалось бы, неве­роятно. Однако это более реально, чем азотфиксирую­щие томаты. Речь снова идет о микроорганизмах, толь­ко живущих в качестве симбионтов и комменсалов (на­хлебников) в желудочно-кишечном тракте. То неболь­шое количество воздуха, которое в нем имеется, практи­чески не содержит кислорода в отличие от плазмы кле­ток. Если создать азотфиксирующих энтеробактерий (а это нетрудно, вспомним про ближайшую родственницу кишечной палочки — Клебсиеллу) и придать им способ­ность сосуществовать с нормальной микрофлорой ки­шечника, то, фиксируя молекулярный азот, такие бакте­рии могли бы стать полезным источником азотного пита­ния животных. А может быть, и людей? В научной лите­ратуре встречались непроверенные спорные сообщения, что в кишечниках аборигенных обитателей влажного тропического леса, пища которых содержит недостаточ­но белков, имеются азотфиксирующие бактерии.

Приведем и достоверный факт. Южные насекомые — термиты (их называют «белыми муравьями», хотя они близки к тараканам) — могут неограниченное время пи­таться одной клетчаткой (например, фильтровальной бумагой). Сами термиты клетчатку (целлюлозу) не пе­реваривают, за них это делают микроорганизмы-сим­бионты, обитающие в их кишечниках. Среди них есть и азотфиксаторы: ведь клетчатка азота не содержит. В ко­нечном счете термиты питаются не клетчаткой, а своими симбионтами. Но стоит термитов подержать при повы­шенном давлении кислорода, как он, проникнув в пище­варительный тракт, отравит нитрогеназы симбионтов, погибнет вся микрофлора кишечника, и термитам одной клетчатки будет недостаточно. Стерильным термитам нужны аминокислоты, на «диете» из одной фильтроваль­ной бумаги они погибнут с голоду.

Аналогичные симбионты, выведенные для домашних животных, решили бы проблему кормов самым радикаль­ным образом. И здесь оптимисты предсказывают появ­ление соответствующих бактериальных препаратов в ближайшем будущем.

Футурологи, пытаются предсказать будущее, прихо­дят к печальному прогнозу. Если сельское хозяйство бу­дет развиваться прежними путями, к 2000 г. на Земле будет недоедать около 2 млрд. людей. Требуются новые, оригинальные решения для того, чтобы обеспечить че­ловечество пищевыми продуктами, и в первую очередь белком. Большую помощь в этом может оказать генная инженерия.

Сельское хозяйство к 2000 г. должно основываться на новых сортах растений, в первую очередь злаковых и бобовых. Пшеница, рожь, рис, кукуруза, соя и другие зернобобовые долго еще останутся основными кормиль­цами человечества. Но они приобретут невиданные свойства. Будущие злаки, как и бобовые, смогут обога­щать почву азотом, не нуждаясь в азотных удобрениях, благодаря симбиотическим азотфиксирующим бакте­риям. Они освободятся от вирусов и приобретут устой­чивость к грибковым и бактериальным заболеваниям. Наконец, зерно их будет содержать значительно боль­шее, чем сейчас, количество белков, в первую очередь богатых незаменимыми аминокислотами. Хлеб из такого зерна по пищевой ценности приблизится к мясу или рыбе. Все это возможно было бы сделать уже сейчас или в ближайшие 10—15 лет.

Сейчас же каждую весну на миллионах гектаров поверхность планеты скальпируется плугами и борона­ми, насыщается инсектицидами и минеральными удобре­ниями. И все это ценой затрат огромного труда, расхо­да невосполнимых нефтепродуктов. И так с весны до осе­ни, каждый год. В результате площадь, пригодная под пашню, сокращается, земля разъедается эрозией. Еще больший вред приносит засолонение поливных полей, занятых хлопком и рисом. Пустыня наступает везде, не только в Сахаре. Ф. Энгельс предсказывал это, когда писал, что за каждый крупный успех природа мстит человеку.

Где же выход? Его давно предсказывали ученые. Соратник Ч. Дарвина А. Уоллес писал, что со временем сахарная пальма вытеснит сахарный тростник, «так как для ее культуры не нужно ни удобрения, ни обработки земли, да и почва истощалась бы далеко не так быстро». Может быть, А. Уоллес ошибался относительно именно пальмы: похоже, углеводами нас обеспечит биотехно­логия. Но общий принцип угадан правильно — деревья вместо однолетних трав!

Наш известный палеонтолог, геолог и писатель-фантаст И. А. Ефремов так характеризует сельское хо­зяйство через тысячу лет: «…отпало трудоемкое ежегод­ное выращивание травянистых и кустарниковых расте­ний. Деревья, долголетние, слабее истощающие почву, устойчивые к климатическим невзгодам, стали основны­ми сельскохозяйственными растениями».

Итак, деревья — хлебные и ягодные, плодовые и ореховые, которые можно выращивать и на склонах гор, не истощающие и не иссушающие почву. Прообраз их — яблоневые и ореховые леса предгорий нашей средней Азии.

Если деревья выгоднее — почему земледельцы так привержены к однолетним злакам? Необходимо помнить, что революционная перестройка жизненно важной от­расли — дело неимоверно трудное.

Сто лет назад великий химик Д. И. Менделеев ска­зал: «Нефть не топливо, топить можно и ассигнациями». Сейчас слова его приобрели еще больший смысл. Ведь из нефти мы можем делать не только пластмассы, по­лимеры, красители, лекарства и многое другое, но и, при­меняя биотехнологические методы, кормовой и пищевой белок. А нефть до сих пор «вылетает в трубу», вернее в выхлопные трубы двигателей внутреннего сгорания.

Замены двигателю внутреннего сгорания на автомо­билях, тракторах, комбайнах, стационарных дизелях до сих пор нет. Экономичные и легкие электрические ак­кумуляторы еще не вышли из стен лабораторий. И не­скоро они вытеснят дизеля: надо закрывать тысячи ста­рых заводов, строить тысячи новых, переучивать сотни тысяч специалистов.

Злаки пока еще заменить нечем. Хозяйственно цен­ные деревья (или хотя бы кустарники и многолетние зла­ки), которые пришли бы им на смену, еще придется со­здавать. И генная инженерия здесь должна сказать свое слово.

По-видимому, растениеводство — вторая после ме­дицины отрасль практической биологии, в которой генно-инженерные методы произведут решающие, революцион­ные перестройки. Конечно, мы будем и дальше улучшать сорта пшеницы и других однолетников, потому что долж­ны заботиться о себе и своих детях. Но мы должны по­думать и о внуках и правнуках. А это значит, что вопрос о коренной перестройке растениеводства науке нужно решать уже сейчас. Ведь вопрос о выведении новых по­род и видов деревьев с заданными свойствами настоль­ко сложен, что для его разрешения и испытания в прак­тике требуются многие десятилетия. И решать его при­дется кому-то из читателей нашей книги.