1 рік тому
Немає коментарів

Sorry, this entry is only available in
Російська
На жаль, цей запис доступний тільки на
Російська.
К сожалению, эта запись доступна только на
Російська.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

В 40-х годах нашего столетия полагали, что у микро­организмов — прокариот, не имеющих оформленного ядра, нет полового процесса, нет и обмена генами. Одна­ко опыты Ф. Гриффитса и Л. А. Зильбера свидетельство­вали, что обмен генами у прокариот все-таки должен существовать.

Невидимые хромосомы бактерий. Сейчас известно по меньшей мере три формы обмена генами — рекомби­нации у бактерий. Первый из них назвали трансформа­цией (превращением)? Именно его обнаружил Ф. Гриф­фитс. Трансформация происходит, когда ДНК из разру­шенных клеток одной бактерии попадает в способные делиться клетки другой.

Названный процесс в природе встречается не так уж часто. Прежде всего далеко не все клетки в культуре бактерий способны к трансформации. Клетки, способ­ные поглощать чужую ДНК, называют компетентными. Чтобы повысить процент компетентных клеток, нужно сохранить в целости молекулы фермента, на какое-то вре­мя открывающего оболочку бактерии для чужеродных генов. Для этого разработаны особые методы. Кроме того, чужая ДНК должна обладать определенным сродст­вом к хозяйской ДНК; иначе включения в бактериаль­ную хромосому не произойдет.

Впрочем, есть ли у безъядерных организмов хромо­сомы? Оказывается, есть. И о строении их узнали до то­го, как увидели в электронном микроскопе. Началось с того, что в 1946 г. американские генетики Дж. Ледер­берг и Е. Тэтум открыли у бактерий процесс, удивитель­но похожий на половой процесс у ядерных одноклеточных — инфузорий, у которых он называется конъюгацией (соединением). Так, инфузории-туфельки соединяются попарно мостиками из цитоплазмы. Через эти мостики происходит обмен ядрами, а затем клетки расходятся. Следует отметить, что в этом случае привычное поня­тие «половое размножение» неточно. Это только у орга­низмов, образующих гаплоидные гаметы, половой про­цесс (обмен генами) объединен с размножением. У ин­фузорий он отделен от размножения, обмен генами (ре­комбинация) существует в чистом виде. Ведь после конъюгации остаются те же две инфузории, которые на­чали ее, но это рекомбинанты, обменявшиеся ядерным материалом.

Конъюгация у бактерий похожа на половой процесс инфузорий, пожалуй, только внешне. Прежде всего обме­на генами здесь не происходит, передача ДНК односто­ронняя. Те клетки, которые отдают ДНК, называют до­норами — «мужскими клетками». «Женские», акцептор­ные, клетки могут ДНК только принимать (рис. 20). Нить ДНК медленно, около полутора часов, перетекает из од­ной бактерии в другую по соединяющей их трубочке. Этот процесс можно в любой момент прервать, сильно встряхивая взвесь бактерий. Тогда соединяющая тру­бочка разорвется и в акцепторную клетку перейдет лишь фрагмент ДНК. Зная, с какой части бактериальной хро­мосомы начинается перенос, можно определить порядок расположения в ней генов.

Клетки кишечной палочки в момент конъюгации...

Клетки кишечной палочки в момент конъюгации…

По каким признакам генетики опознавали бактери­альные гены? Чаще всего по способности бактерий син­тезировать разные химические вещества, например ами­нокислоты. Обычный объект таких опытов бактерия ки­шечная палочка — Echerichia coli. Она может расти и в природных средах, но больше всего ее в кишечнике человека и в его экскрементах. Она постоянный спутник человека и свидетель загрязнения воды, почвы и пище­вых продуктов.

Микробиологи, изучавшие бактерий недавно найденного в Ма­гаданской области замороженного мамонтенка Димы, были очень огорчены: во всех посевах проросла вездесущая кишечная палочка. Удивляться нечему: перед появлением микробиологов мамонтенка смотреть сбежался весь поселок и не у всех руки были чистые.

Обычные, «дикие», штаммы кишечной палочки не­прихотливы. Для них пригодна среда с глюкозой (источник углерода и энергии), фосфатом (источник фосфора) и какой-либо солью аммония (источник азота). Все ами­нокислоты и нуклеотиды они синтезируют сами. Это организмы-прототрофы. Близкой родственнице Е. Coli Clebsiella не нужен даже аммоний: в бескислородной сре­де кишечника она может синтезировать его из молеку­лярного азота атмосферы (в тканях человека и содержи­мом кишечника немало растворенного N2).

Из этих «диких» штаммов генетики вывели «каприз­ные» штаммы, которые не могут синтезировать необхо­димые им вещества из аминокислот или витаминов; что­бы они росли, в среду следует добавлять нужное соеди­нение. Такие мутанты-«неженки» называют ауксотро­фами. Исследуя их, можно установить, сколько генов участвует в синтезе какого-либо соединения (синтез гистидина, например, контролируют десять генов).

Не менее важные признаки — устойчивость к анти­биотикам, способность использовать в качестве источни­ка энергии разные вещества, подвижность, патогенность, наконец, форма колонии на твердой среде.

Поставим такой опыт. Проведем конъюгацию клеток двух штаммов: ауксотрофного (акцептор) и «дикого», прототрофного (донор). Получив от донора неповрежден­ный ген, клетка акцептора вновь обретает утерянную способность, в частности, сбраживать молочный сахар-лактозу. Ограничив время конъюгации, можно довольно точно определить, в каком месте хромосомы этот ген находится (за единицу расстояния обычно принимают 1 минуту времени вхождения «мужской» хромосомы в «женскую»). Сейчас длину генов измеряют в тысячах нуклеотидных пар ДНК.

Так построили первые карты бактериальных хромо­сом. Оказалось, что единственная бактериальная хромо­сома не имеет ни начала, ни конца. Это замкнутая, коль­цевая молекула ДНК с длиной окружности около 0,2 см (естественно, это кольцо многократно скручено: иначе оно просто не уместится в клетке микронных разме­ров).

На рисунке 21 дан фрагмент генетической карты хро­мосомы кишечной палочки штамма К12, полученной одной из первых. Символами показаны разные гены: Arg A — первый по счету ген, обусловливающий спо­собность к синтезу аргинина; Ага — способность сбра­живать углевод арабинозу; Sm — устойчивость к анти­биотику стрептомицину и т. д.

Зададимся вопросом: что определяет «пол» у бакте­рий, почему одна из них оказывается донором, а другая акцептором? У человека, например, мужской пол опреде­ляет Y-хромосома, вторая Х-хромосома в женском на­боре остается неактивной. Нет ли чего похожего у конъюгирующих бактерий?

Карта кольцевой хромосомы кишечной палочки

Карта кольцевой хромосомы кишечной палочки

Оказалось, что не менее 90% всех известных штаммов кишечной палочки — акцепторы, остальные — доноры. Способность к донорству может исчезнуть, если подейст­вовать на клетки донорского штамма ультрафиолетом или мутагенами, например акридиновыми красителями. Наконец, способность к донорству можно передать от клетки к клетке, превратить акцептора в донора. Следо­вательно, в донорских клетках есть какой-то материаль­ный объект, содержащий ДНК (или состоящий из ДНК), который и отвечает за передачу генетической информа­ции. Он образует мостик, по которому ДНК из одной клет­ки переходит в другую, может сам перейти по тому же мостику в клетку акцептора, придав ему донорские свойства, и может сам мутировать, как хромосома. Его назвали фактором F. Казалось, это аналог Y-хромосомы у мужчин. Однако схожесть была лишь внешняя.

Чтобы понять, что такое фактор F, вернемся в 1915— 1917 гг., когда были открыты вирусы бактерий — бакте­риофаги (или просто фаги).

Бактерии и вирусы. В 1915 г. канадский француз Ф. Д.’Эррель обнаружил у саранчи заразное заболева­ние — понос, приводящий к гибели насекомого. Его вы­зывали бактерии — коккобациллы. Размножая вновь открытую бактерию на среде с твердым агаром, Д’Эррель столкнулся с любопытным явлением: во многих чашках Петри на поверхности агара, заросшей слоем бактерий, появлялись мелкие прозрачные пятна — места, в кото­рых бактерии погибли (теперь их называют бляшками). А в жидких средах культуры вдруг погибали, бактериаль­ные клетки распадались, лизировались.

Такие случаи наблюдали и другие микробиологи, но лишь Д’Эррель догадался, что имеет дело с вирусом — паразитом бактерий и что он открыл паразита саранчи и паразита этого паразита! Он же первый предложил термин «бактериофаг» — пожиратель бактерий.

Очень быстро выяснилось, что фаги широко распро­странены. Д’Эррель обнаружил их у дизентерийной па­лочки, а потом их нашли практически у всех микроорга­низмов, вызывающих самые разнообразные болезни — от чумы до скарлатины. Возникла идея фаговой тера­пии — лечение болезней фагами, имевшая большой успех в 20-х годах.

К огорчению врачей, оказалось, что многие фаги, уби­вая одни клетки бактерий, оставляют живыми другие клетки того же штамма, которые продолжают делать свое «черное» дело. Причина этого загадочного явления стала понятной лишь в конце 40-х годов благодаря бле­стящим работам знаменитого французского биохимика Андрэ Львова. А. Львов родился и вырос во Франции, но его родители русские. Отец ученого был политическим эмигрантом, осевшим во Франции до Октябрьской рево­люции, а мать известна каждому из нас: она изображе­на на картине В. Серова «Девушка, освещенная солн­цем».

Отметим, что бактериофаг — это ДНК (значительно реже встречаются РНК-содержащие фаги), заключен­ная в капсулу из белковых молекул. Попадая в бакте­рию (у сложных фагов есть очень хитроумные устройст­ва, с помощью которых они «впрыскивают» в хозяйскую клетку свою ДНК; см. рис. 20), ДНК фага начинает «подрывную деятельность»: выключает синтез хозяйских белков, синтезирует свои иРНК; на них как на матрицах рибосомы хозяина синтезируют фаговые белки. Сама фаговая ДНК активно реплицируется в клетке-хозяине. ДНК фагов либо кольцевая, либо становится кольце­вой, попадая в бактериальную клетку. Далее ДНК встраивается в фаговые частицы, которые в большом числе накапливаются в клетке-хозяине и в конце концов разрушают ее.

А. Львов установил, что в части клеток, заражае­мых некоторыми фагами, фаговая ДНК не образует фаговых частиц, а вместо этого встраивается в хромосому хозяина. Фаговая ДНК, или, как говорят, геном фага, реплицируется в составе хромосомы бактерии и вместе с ней передается из поколения в поколение. Встроенная фаговая ДНК направляет синтез только одного белка-репрессора, который не позволяет ей выйти из генома хозяина. Этот же белок не позволяет другим фаговым ДНК, попадающим в бактериальные клетки, хозяйничать в них. Таким образом, бактерии, в геном ко­торых встроена фаговая ДНК, устойчивы (иммунны) к воздействию такого же фага, что и является зачастую причиной нечувствительности болезнетворных бактерий к бактериофагам. Это явление широко распространено в мире паразитов. Например, человек, имеющий в своем кишечнике солитера, не заражается его личинками повторно. Солитер всегда один — потому он и называется солитером («одиноким»).

Если же белок-репрессор разрушить (это происхо­дит, в частности, при облучении клетки ультрафиоле­товым светом), то фаговая ДНК выходит из генома хо­зяина и ведет себя в клетке так, словно попала в нее извне, т. е. в конце концов лизирует клетку. Фаги, спо­собные встраиваться в геном хозяина, носят название лизогенных (их называют, кроме того, умеренными, так как они не всегда убивают клетку), а про клетку, кото­рая в своем геноме несет такой фаг, говорят, что она на­ходится в лизогенном состоянии.

Изучению умеренных фагов посвящено множество работ, и некоторые из них имеют самое непосредствен­ное отношение к возникновению генной инженерии.

Чудесные ферменты — рестриктазы. Давно замечено, что наиболее детально исследованный из умеренных фа­гов — бактериофаг λ, паразитирующий в клетках штам­ма К кишечной палочки и выделенный после лизиса этих клеток, может лишь с очень низкой эффективностью за­ражать клетки другого штамма этой бактерии — штам­ма В. И только те немногие фаговые частицы, которые выжили в штамме В, охотно паразитировали в клетках этого штамма, но зато теряли способность заражать штамм К. Эти штаммы представляют собой два очень близких варианта кишечной палочки. Пытаясь выяснить причины столь странного поведения фага λ, ученые от­крыли чрезвычайно важное явление — рестрикцию-мо­дификацию ДНК в клетках бактерий. Вот в чем суть на­званного явления.

В клетках кишечной палочки постоянно образуются ферменты — эндонуклеазы, которые узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности и разре­зают ее двойную спираль в этих местах. Позже мы расска­жем более подробно, как это происходит. Эндонуклеазы (теперь они широко известны под названием эндонук­леаз рестрикции или просто рестриктаз) и разрушали ДНК фага λ в штамме В кишечной палочки. Но тогда возникают вопросы: что в штамме К вообще нет рестрик­таз? Почему рестриктазы в штамме В не разрушают свою собственную ДНК, а заодно и ДНК фага, который на них паразитирует?

Оказалось, что в штамме К рестриктазы есть, но иные: они расщепляют ДНК по другим участкам. Более того, в клетках штамма К есть фермент, который модифици­рует (метилирует, присоединяет метильную группу СН3) основание в участке ДНК, узнаваемом ресриктазой этого штамма, и делает его для нее недоступным, т. е., попросту говоря, защищает ее ДНК от своих рестриктаз. Вся ДНК, которая синтезируется в бактериальной клет­ке, подвергается защите уже в момент своего образова­ния. Когда же в клетку попадает чужеродная незащи­щенная метилированием ДНК, рестриктазы расщепляют ее на куски, которые станут «жертвой» других, уже ме­нее специфичных нуклеаз. И лишь те молекулы чужерод­ной ДНК, которые успевают модифицироваться фермен­тами модификации, могут в этих клетках функциониро­вать. Вот почему небольшой части ДНК фага λ из штам­ма К удается спастись в штамме В. Их спасают «забе­жавшие вперед» ферменты — метилазы хозяйской клетки.

Сейчас известно уже несколько сотен различных рест­риктаз из множества бактерий. Если вы внимательно ознакомитесь с рисунком 22, в котором приведены наибо­лее широко употребляемые рестриктазы, то увидите, что они отличаются друг от друга не только нуклеотидными последовательностями, по которым они расщепляют ДНК, но и по способу действия. Одни рестриктазы обра­зуют однотяжевые участки длиной в четыре нуклеотидных остатка, другие — в два остатка, третьи разрезают ДНК так, что однотяжевых участков вообще не возни­кает. И самое важное: участки узнавания ДНК многи­ми рестриктазами обладают симметрией второго порядка. Что это такое? Рассмотрим участок ДНК, узнаваемый и разрезаемый одной из рестриктаз кишечной палочки, известной под названием Eco RI (см. рис. 22).

Плазмида pBR 322...

Плазмида pBR 322…

Если в центре этой шестичленной последовательно­сти мысленно провести ось (перпендикулярно плоскости листа), а затем повернуть эту последовательность на 180° в плоскости чертежа, то получим ту же нуклеотидную последовательность. Иными словами, нуклеотидный текст, записанный в этой, последовательности, можно читать как слева направо, так и справа налево (помня только об асимметричности межнуклеотидных связей), и он будет одним и тем же. В лингвистике такие тексты называют перевертышами («А роза упала на лапу Азора»). И еще одна очень важная особенность разрыва, генерируемого в ДНК рестриктазами: образующиеся на концах однотяжевые последовательности ДНК комплементарны друг другу; их образно называют «липкими» концами, с их помощью фрагменты ДНК можно снова соединить (слепить) друг с другом.

Нуклеотидные последовательности, узнаваемые рест­риктазами, встречаются в ДНК достаточно редко. При этом шестичленные участки узнавания, естественно, встречаются реже, чем четырехчленные (например, в ДНК бактериофага Т7 длиной в 35 000 пар нуклеотидов нет ни одного участка узнавания рестриктазой Eco RI). Это позволяет строить карты рестрикции ДНК различ­ных вирусов и фагов. Пример такой карты показан на рисунке 22. Нужно только представлять себе, как удает­ся разделить такую сложную смесь фрагментов ДНК (называемых рестрикционными фрагментами), а за­тем расположить эти фрагменты в нужном порядке на карте.

Разделяют рестрикционные фрагменты методом элек­трофореза в студнеобразной среде — геле. Как и любая другая кислота, ДНК в среде, близкой к нейтральной, заряжена отрицательно. Следовательно, если взять пластинку, сделанную из пористого материала (в случае крупных рестрикционных фрагментов ДНК таким мате­риалом служит гель из природного полисахарида — ага­розы), пропитанную раствором электролита, на один из концов пластинки нанести раствор ДНК, поместить эту пластинку между двумя электродами и приложить к ним разность потенциалов так, чтобы положительный электрод находился на удаленном от образца ДНК кон­це пластинки, то молекулы ДНК будут двигаться в на­правлении от катода к аноду (от — к + ). Так как в про­цессе электрофореза макромолекулам ДНК приходится преодолевать сопротивление, которое создает полимер­ная сетка геля (образно говоря, протискиваться сквозь ячейки в сетке геля), то чем крупнее фрагмент ДНК, тем медленнее он будет двигаться. В конце концов все фраг­менты ДНК распределятся на пластинке с агарозным гелем в соответствии с их длиной. Их можно увидеть, например, в виде яркосветящихся, флуоресцирующих в невидимом ультрафиолетовом свете полос, если в элект­ролит перед электрофорезом добавить краситель броми­стый этидий, который образует с ДНК флуоресцирующие комплексы. Изменяя в геле концентрацию агарозы, мож­но придавать ему разную плотность — от полужидкого до твердого, как мармелад (это лакомство как раз и делают на основе агароз), и, следовательно, разделять фрагменты ДНК желаемой длины.

Для того чтобы узнать последовательность располо­жения фрагментов ДНК, надо изучить порядок появле­ния фрагментов в ходе частичного расщепления рест­риктазой. Например, если в простейшем случае ДНК расщепляется рестриктазой на три фрагмента — А, В и С, а при неполном гидролизе этой ДНК той же рестрик­тазой получается более длинный фрагмент, который при дальнейшем расщеплении дает фрагменты А и В, то порядок фрагментов именно такой, как на рисунке 22. Так получают карты генов, называемые рестрикционными. Как вы увидите дальше, они совершенно необходи­мы генным инженерам в их практической работе.

Первыми догадались применить рестриктазы для по­лучения индивидуальных генов Стэнли Коен из Стэн­фордского университета и его коллега из Калифорний­ского университета (США) Герберт Бойер в 1972 г. К это­му времени эти ученые были уже хорошо известны бла­годаря своим работам по плазмидам бактерий.

Плазмиды — дар природы генным инженерам и про­клятие врачей. Плазмиды — кольцевые молекулы ДНК, размером от 2—3 до нескольких десятков тысяч пар осно­ваний. Они существуют и реплицируются независимо от хромосомы бактерии, хотя и используют для этого тот же самый ферментативный аппарат клетки. Плазмиды, как и некоторые умеренные фаги, — одни из главных «героев» этой книги, а почему — вы скоро узнаете.

Многие плазмиды могут передаваться от одной бак­терии к другой при конъюгации. Их называют трансмис­сивными (трансмиссия — передача, перенос). У всех трансмиссивных плазмид имеются гены, отвечающие за синтез особого белка — пилина. Именно этот белок сла­гает трубочки (ворсинки — пили), по которым ДНК при конъюгации переходит из клетки в клетку. Но то же де­лает и половой фактор: F — фактор бактерий. Не плаз-мидой ли он является? Действительно, это трансмиссив­ная плазмида, специализирующаяся на переносе хо­зяйских генов. И «мужские» клетки-доноры — это просто клетки-акцепторы, зараженные такой плазмидой (те­перь, кроме фактора F, описаны и другие плазмиды, ока­зывающие хозяевам такие же «услуги»).

Генетики быстро разобрались и в том, как происходит генетическая рекомбинация у бактерий при конъюгации. Старая хромосома и новая, перетекшая в клетку через пилиновую трубочку, построенную фактором F, образуют комплекс — две нити ДНК соединяются гомологичными местами. Обычно гаплоидная, однохромосомная, клет­ка бактерии на какое-то время становится диплоидной. Далее происходит процесс, очень похожий на кроссин-говер у высших, ядерных, организмов. Лежащие рядом хромосомы обмениваются генами и группами генов. А затем при делении клеток хромосомы расходятся, бак­терии снова становятся гаплоидными — до очередной конъюгации.

Теперь перейдем к явлению трансдукции (переноса). Как вы помните, для передачи генетической информации у бактерий требуется или наличие лизированных клеток, т. е. свободной ДНК (трансформация), или физический контакт клеток при половом процессе. При трансдукции не требуется ни того ни другого.

Дж. Ледерберг, открывший «пол» у бактерий, поста­вил изящный опыт. Он взял U-образную трубку, оба ко­лена которой разделялись фильтром из пористого стек­ла, — так называемую трубку Дэвиса. Микробиологи ее применяют, когда изучают действие веществ, выде­ляемых одним микробом на развитие другого. Ведь мик­робы не проходят через узкие поры, а молекулы их метаболитов проходят. Но через них проходят и фаги.

В одно колено трубки наливали культуру ауксотрофных бактерий, не способных синтезировать какую-либо аминокислоту, а в другое — культуру «диких», автотрофных (иногда штаммы двух ауксотрофов, но разных, с раз­ными генетическими дефектами). В конце опыта ауксотрофы приобретали способность синтезировать эту аминокислоту! Может быть, протейная палочка в опыте Л. А. Зильбера таким же образом приобрела признак сыпнотифозной: ведь их разделяла полупроницаемая мембрана?

Основное условие успеха опыта: штаммы должны быть заражены лизогенным (умеренным) фагом. Фаги могут переносить генетическую информацию (гены) от одной хозяйской клетки к другой.

Бактерии вместо типичного полового процесса, свой­ственного эукариотам, разработали иные способы ре­комбинаций, не менее эффективные. Вы скажете: все это, конечно, очень любопытно, но что нам до обмена генов у бактерий, какое это может иметь практическое значение? Первостепенное, и примеры, которые мы при­ведем, убедят вас в этом.

Дифтерию сейчас научились успешно лечить, одна­ко раньше она уносила немало жизней, особенно дет­ских. Мало кто знает, что сама по себе дифтерийная палочка неопасна. Она вызывает лишь легкое ангино­подобное заболевание. Смертельно опасен лишь выде­ляемый ею яд — дифтерийный токсин, вызывающий общее отравление организма. Это токсин белковой природы, а ген, определяющий его синтез, находится в плазмиде дифтерийной палочки!

Другой не менее опасный для человека токсин — холерный, выделяемый холерным вибрионом. Описан случай вспышки холероподобного заболевания, при ко­тором вибрионы не были обнаружены. Оказалось, что ген холерного токсина в результате трансдукции или трансформации попал в вездесущую кишечную палоч­ку.

Когда в практику медицины вошли антибиотики, врачи были убеждены, что наступила золотая эра медицины, что все бактериальные болезни будут побеж­дены. Высказывались, в частности, утверждения, что в наши дни можно было бы вылечить Пушкина, тяже­ло раненного на дуэли. Сшить поврежденный пулей кишечник врачи могли и тогда, но смертельный сеп­сис (заражение крови) был бы неизбежен. Вот если бы в распоряжении врачей, лечивших Пушкина, имелся пенициллин! Увы, сейчас медики вряд ли будут утверж­дать так решительно. Бактерии приспосабливаются к ан­тибиотикам так же легко, как и к фагам. Причина — жесточайший отбор устойчивых к антибиотику бак­терий.

Задумались ли вы, почему плесневые грибки, бакте­рии и другие микроорганизмы синтезируют лекарства для человека? Оказалось, что антибиотики имеют мно­го родственных соединений, участвующих в обмене веществ у микробов. Часто соединение, безвредное для одного микроорганизма, для другого ядовито — и об­ладатель его вытесняет из питательной среды конку­рентов. Пенициллин открыл английский ученый А. Фле­минг, подметивший, что вокруг колоний плесени рода Penicillium образуется стерильная, свободная от бак­терий зона. Стенка клетки бактерий слагается из длинных цепочек азотсодержащих полисахаридов — аце­тилглюкозамина и ацетилмурамовой кислоты, сшитых короткими цепочками аминокислотных остатков — пептидами. В этих пептидах необычные формы амино­кислот: глутаминовая кислота правая, а аланин и правый, и левый. Поэтому оболочки бактериальных кле­ток не расщепляются обычными ферментами — про­теазами.

Пенициллин как раз блокирует рост этих пептид­ных мостиков, клеточная стенка не растягивается, и бактерия лопается. А так как пенициллин практически нетоксичен для эукариот, он и получил распространение как лекарство. Лишь те бактерии, которые в резуль­тате отбора тем же пенициллином «научились» рас­щеплять его, не боятся высоких концентраций антиби­отика. Другие антибиотики действуют на бактерии по-иному; левомицетин, например, подавляет у них синтез белка; стрептомицин искажает течение белкового син­теза на рибосомах, в белок включаются не те амино­кислоты, которые нужны, и продукт синтеза оказывает­ся дефектным.

По-разному бактерии приспосабливаются к ним. Порой антибиотик не расщепляется, а модифицируется каким-нибудь ферментом — достаточно иногда присое­динения или отщепления метильной группы, чтобы он потерял свои полезные для человека свойства. При чем же тут плазмиды? — спросите вы. Дело в том, что гены, кодирующие ферменты, расщепляющие или модифицирующие антибиотики (пенициллин и тетра­циклин, стрептомицин и левомицитин), могут перено­ситься от бактерии к бактерии вирусами и плазмидами. Устойчивость к антибиотикам может передаваться в мире микробов, не считаясь с видовыми границами. Ведь у кишечной и чумной палочки есть общие трансмиссивные плазмиды.

Мрачную известность получили в последнее время устойчивые ко многим антибиотикам штаммы золотис­того стафилококка — причина многих послеоперацион­ных осложнений. Единственное эффективное средство против него — антистафилококковый гаммаглобулин, т. е. антитело на оболочечные антигены этого микроба. К сожалению, пока он выделяется из донорской крови и потому малодоступен.

Мы привели лишь очень немногие факты, показывающие, почему надо изучать взаимоотношения виру­сов, плазмид и бактерий.

Встает вопрос: как выделять плазмидную ДНК в чи­стом виде? Несколько способов получения чистых плаз­мид уже разработано. Опишем самый распространен­ный.

Сначала во взвесь бактериальных клеток добавля­ют вещества, разрушающие их оболочки. Клетки раз­рушаются, лизируются, и ДНК переходит в раствор. Лизис виден невооруженным глазом: мутная легкопод­вижная жидкость превращается в прозрачную, вязкую. Получается смесь бактериальной ДНК и плазмидной, но судьбы их разные. Кольцевые хромосомы бактерий огромны, и получить их целыми очень сложно: они ломаются на линейные фрагменты.

Иное дело — плазмидная ДНК или ДНК умеренных фагов. Ее кольца много меньше, чем у бактерий; у са­мых малых плазмид молекулярная масса всего около 2,5 млн. дальтон. К тому же они компактно уложены (суперскручены) и имеют все шансы сохраниться це­лыми. Как разделить смесь линейной ДНК бактерии и кольцевой (плазмиды)? Сейчас чаще всего исполь­зуют центрифугирование в градиенте концентрации тя­желой соли, например хлористого цезия. В раствор ДНК добавляют CsCl и откручивают на центрифуге при высоких скоростях — до ускорения, в 105 тыс. превы­шающего нормальное земное. В таких условиях создается градиент концентрации CsCl, которая уменьшается от дна пробирки к поверхности. В этом градиенте моле­кулы ДНК всплывают или тонут, пока не остановятся в слое с равной плотностью. Так, воздушный шарик, за­полненный водородом, взлетает к разреженным слоям атмосферы, пока не уравновесится. Нагрузите его по­больше — он остановится на меньшей высоте, а то и не взлетит.

То же происходит и с молекулами. Тяжелая, плотная РНК «проваливается» на дно пробирки. Легкие белки образуют слой под мениском. А ДНК образует полосы, располагаясь слоями по удельной плотности.

Если бактериальная и плазмидная ДНК по этому признаку отличаются, разделить их легко. Если же не различаются, разделить смесь очень нелегко. На по­мощь приходит светящийся в ультрафиолетовых лучах краситель — бромистый этидий, или этидий бромид — ЭБ. ЭБ встраивается в полинуклеотидные цепи между основаниями, несколько раздвигая их. Молекула нукле­иновой кислоты в комплексе с ЭБ удлиняется, а плот­ность ее уменьшается. Линейные фрагменты ДНК мож­но насыщать ЭБ до предела. Иное дело — кольцевые молекулы. Сначала они переходят из сверхскрученного состояния в правильное кольцо. Такое кольцо называют релаксированным. Релаксированная кольцевая ДНК не­охотно связывается с ЭБ. Так возникает разница в удельных плотностях. В ультрафиолете через полу­прозрачную стенку пластиковой пробирки видны две светящиеся оранжевым светом полоски: тонкий слой плазмидной ДНК и широкий — хромосомной. Каждую из них можно отсосать отдельно, проколов иглой шпри­ца стенку пробирки. ЭБ хорошо отделяется от ДНК спиртом (ДНК выпадает в осадок, а ЭБ остается в раст­воре).

Это очень распространенный способ, хотя есть и дру­гие. Он привлекателен еще и тем, что исследователь видит материал, с которым работает, невооруженным глазом, что бывает в молекулярной биологии и генной инженерии нечасто.

Раньше генетики предсказывали устройство плазмидных и фаговых ДНК только экспериментально, не видя их; теперь они могли видеть отдельные кольца в элект­ронном микроскопе и работать с генами как с химиче­скими веществами.

В свою очередь, генетика микроорганизмов принесла будущей генной инженерии неоценимый дар — селек­тивные среды.

Селекция означает отбор. Иногда в популярной ли­тературе можно встретить такое утверждение. Рань­ше, мол, генетики только отбирали случайные измене­ния генов, а мы теперь направленно тасуем гены, и от­бор нам не нужен. Запомните: такое утверждение без­грамотно. Наоборот, в генетике бактерий и генной ин­женерии понятие искусственного отбора обрело новую жизнь. Ведь все события, о которых мы рассказали в этой главе, будь то трансформация или трансдукция, происходят с низкой частотой. Как найти редкое генети­ческое событие? Только отобрав его из массы ненуж­ных. А отбор эффективен, когда есть из чего отбирать. В массовой популяции можно обнаружить редчайший вариант.

Обычная концентрация бактерий — миллион клеток в миллилитре. А отбор проводят селективные среды.

Первым селективную среду использовал С. Н. Ви­ноградский в 1894 г. в поисках свободноживущего микроорганизма, усваивающего молекулярный атмос­ферный азот. Обычно микробиологи выращивают ко­лонии бактерий и грибков на питательных средах, со­держащих агар (азотсодержащий полисахарид, полу­чаемый из водорослей) или желатину. Несколько ка­пель материнской культуры размазывают шпателем по поверхности твердой среды и помещают в термостат. На тех местах, куда попали клетки, способные расти на та­кой среде, вырастают колонии, каждая из которых — потомство одной исходной клетки.

С. Н. Виноградский вместо агара или желатины применил гель кремниевой кислоты, иначе говоря, затвер­девший силикатный клей Na2SiO3 с добавками Сахаров и солей, но без азота. Поэтому любая колония, вырос­шая на такой среде, автоматически оказывалась азотфиксирующей: ведь необходимый для жизни азот она могла получить только из воздуха.

Метод селективных сред оказался очень эффектив­ным. Продемонстрируем лишь несколько примеров его успешного применения.

Дана задача: из многих миллиардов клеток «дикой», автотрофной бактерии отобрать те, которые потеряли способность синтезировать незаменимую аминокислоту гистидин. С этой целью культуру бактерий выращивают в жидкой среде без гистидина, но с высокой концен­трацией антибиотика пенициллина. Те клетки, которым гистидин не нужен, начинают расти: тут же оболочки их лопаются и бактерии погибают. Ведь пенициллин останавливает рост их оболочек, и увеличивающаяся в объеме цитоплазма разрывает клетку. Нуждающиеся в гистидине ауксотрофы остаются живы — они без него не растут. Остается осадить культуру в центри­фуге, отмыть от пенициллина чистой средой и пере­сеять на твердую среду, содержащую гистидин. Таким способом можно отобрать одну нужную бактерию из сотен миллионов и за сутки получить от нее много­миллионное потомство.

Еще проще получить выращиванием на агаре с анти­биотиком культуру бактерий, к этому антибиотику ус­тойчивых. Когда в Японии обнаружили возбудителя ангины, устойчивого к стрептомицину, генетики бакте­рий, заинтересовавшись этим фактом, получили штам­мы ангинового стрептококка, для роста которых стреп­томицин был необходим. Так у Стругацких («Поне­дельник начинается в субботу») Модест Матвеевич Кам-ноедов, борясь с нетопырями в вестибюле института, вывел породу, питающуюся пиретрумом, смешанным с хлорофосом.

Работа с плазмидами очень облегчается тем, что многие из них содержат гены, обеспечивающие хозяй­ским клеткам устойчивость к антибиотикам. Раньше их называли R-факторами (от английского resistance — устойчивость). Допустим, нам нужно заразить какую-нибудь культуру плазмидой и отобрать зараженные клетки. Проинкубируем взвесь нужных бактерий с этой плазмидной ДНК и сделаем посев на селективной среде с антибиотиками. Известно, что плазмида имеет ген устойчивости. Значит, только зараженные ею клетки прорастут в колонии на ядовитом агаре, остальные по­гибнут.

Некоторые плазмиды содержат гены таких фермен­тов, которые позволяют хозяйским клеткам усваивать в качестве источника вещества и энергии новый, не­привычный субстрат, например фенол или нефтяные углеводороды. Генетики микроорганизмов недавно вы­вели любопытный штамм бактерии из рода Псевдомо­нас. Клетки его содержат сразу несколько таких плаз­мид, что им позволяет усваивать все основные ком­поненты нефтяного загрязнения. Этой бактерии при­дается важное значение в охране окружающей среды.

Успехи практического применения генетики микро­бов стали особенно значительными в последние 30 лет. У многих людей стали возникать заманчивые идеи, суть которых можно свести к следующему. Пока гене­тическая рекомбинация у бактерий приносит человеку больше вреда, чем пользы. Достаточно вспомнить ус­тойчивость к антибиотикам, которая в мире микро­бов распространяется как эпидемия. Но теперь, когда мы знаем механизм действия плазмид умеренных фа­гов, что мешает заставить бактерию, ту же кишечную палочку, синтезировать в культуре нужный нам белок, например какой-нибудь человеческий гормон или фер­мент?

Уже есть система для переноса кусочка ДНК в клет­ку — плазмида или умеренный вирус. Эти трансмис­сивные кольцевые молекулы ДНК назвали векторами. Есть фермент, который «пришьет» нужный ген к моле­куле-вектору (ДНК-лигаза). И пусть этот акт пере­носа генетической информации происходит с ничтож­ной частотой — волшебные селективные среды позво­ляют нам его выявить. Остается научиться получать фрагменты ДНК с нужной нуклеотидной последователь­ностью. И тут С. Коен и Г. Бойер, о которых мы уже говорили, одни из первых вспомнили о рестриктазах. Именно эти ферменты, расщепляющие ДНК в заданном месте, проложили последний участок дороги, ведущий к власти над геном.