1 рік тому
Немає коментарів

Sorry, this entry is only available in
Російська
На жаль, цей запис доступний тільки на
Російська.
К сожалению, эта запись доступна только на
Російська.

For the sake of viewer convenience, the content is shown below in the alternative language. You may click the link to switch the active language.

Разрезать и склеивать гены помогают ферменты. В наши дни идея С. Коена и Г. Бойера выглядит очень простой. Разрежем плазмиду одной из рестриктаз, об­разующих у фрагмента ДНК однотяжевые («липкие») концы. Той же рестриктазой разрежем на фрагменты ДНК, в одном из которых содержится интересующий нас ген. Если смешать эти фрагменты с разрезанной плазмидой, то с некоторой вероятностью они склеят­ся с плазмидой благодаря «липким» (комплементар­ным) концам. Далее чужеродную ДНК ковалентно при­шивают к вектору ДНК-лигазой. В итоге получается созданная по заранее разработанному плану рекомбинантная ДНК, а весь план этого замечательного эксперимента умещается на небольшом чертеже (рис. 23).

Схема получения рекомбинантной ДНК по Коену - Бойеру

Схема получения рекомбинантной ДНК по Коену – Бойеру

Следующий шаг к схеме Коена — Бойера заключал­ся в переносе рекомбинантной плазмиды в бактериаль­ную клетку: только в клетке она может размножиться. Более того, как видно из рисунка, наряду с рекомбинантными ДНК в опыте Коена — Бойера всегда будет восстанавливаться (замыкаться) исходный век­тор. И только после переноса в клетку эти молекулы ДНК можно легко отличить друг от друга. В то же время все подходящие на роль вектора плазмиды, ко­торыми располагали С. Коен и Г. Бойер, оказались нетрансмиссивными, т. е. неспособными переходить из клетки в клетку. Тогда ученые предложили простую процедуру переноса плазмид в бактериальные клетки: клетки необходимо предварительно обработать хлори­стым кальцием.

Теперь С. Коен и Г. Боейр могли приступить к экс­периментальной проверке своей идеи. В их коллекции оказалась пара плазмид, у которых было всего по од­ному участку узнавания рестриктазой, — Eco RI. К тому же эти плазмиды несли гены устойчивости к раз­ным антибиотикам: одна — к тетрациклину, а дру­гая — к канамицину.

Эксперимент был осуществлен по приведенной вы­ше схеме. Полученные плазмиды перенесли в бакте­риальные клетки (использовали специальный штамм кишечной палочки, лишенный тех рестриктаз, которые могли бы разрушить вектор) и высеяли на среду, со­державшую оба антибиотика. Ни исходная культура, ни клетки, в которые попали исходные векторы, на та­кой среде расти не могли. Росли на ней клетки, полу­чившие гены устойчивости к обоим антибиотикам, т. е. содержавшие рекомбинантную плазмиду. Впервые по заранее разработанному плану удалось сконструиро­вать ДНК с заданными свойствами. Работа С. Коена и Г. Бойера напоминала конструкторскую разработку, да и оперировали они рестрикционными картами плаз­мид, а их можно сравнить с чертежами, которыми пользуется инженер-конструктор. Генетика вступила в новую эру — эру генной инженерии!

Если строго следовать историческому ходу научных событий, нужно признать, что еще за год до С. Коена и Г. Бойера в том же Стэнфордском университете (недаром его называют родиной генной инженерии) П. Лобан и П. Берг первыми получили рекомбинантные ДНК, встроив в вектор фрагменты чужеродной ДНК. Однако схема их экспериментов была иной.

На концы векторной молекулы (в виде линейной ДНК) с помощью специального фермента терминаль­ной (концевой) нуклеотидтрансферазы нарастили ко­роткие полинуклеотидные последовательности, состо­ящие из одного и того же нуклеотида — А (такие последовательности, в данном случае поли-А, называют гомополинуклеотидными):

АААА векторная ДНК АААА

Концы фрагментов ДНК, среди которых был и фраг­мент, содержавший искомый ген, таким же способом нарастили, но уже полинуклеотидом, комплементар­ным поли-А, т. е. поли-Т-последовательностями.

Дальше, смешав вектор с фрагментами, ученые по­лучили их гибрид — рекомбинантную ДНК вследствие комплементарного спаривания поли-А и поли-Т-после-довательностей. Затем фрагмент ДНК и вектор сшили ДНК-лигазой (рис. 24).

Конструирование рекомбинантной ДНК по Лобану - Бергу

Конструирование рекомбинантной ДНК по Лобану – Бергу

Недостаток такого подхода очевиден: П. Лобан и П. Берг использовали фрагменты ДНК, полученные при ее расщеплении случайным образом. Тем не менее их метод нашел дальнейшее развитие: во многих слу­чаях оказалось удобным, расщепив рестриктазами век­тор и ДНК с искомым геном, наращивать полученные концы комплементарными последовательностями. В 1980 г. П. Берг был одним из тех, кто получил Нобе­левскую премию за работы, приведшие к созданию ген­ной инженерии. П. Лобан же, завершив свою работу, вообще покинул биологию. Почему это произошло, мы расскажем в конце этой главы.

Векторы. Рассмотрим векторные системы, которыми пользуются современные генные инженеры. Сформули­руем требования, которым должны удовлетворять век­торные молекулы ДНК:

— они должны обладать способностью реплициро­ваться (размножаться) в клетке-реципиенте; для этого в вектор вводят специальный участок, с которого начинается репликация ДНК (в нем находятся нуклеотид­ные последовательности, служащие сигналами начала репликации);

— они должны содержать один или несколько мар­керных генов (от слова «маркировать» — метить, обо­значать), которые придают клетке-реципиенту новые признаки, позволяющие отличить клетки с вектором от исходных клеток; этим признаком бывает устой­чивость к какому-либо антибиотику;

— они должны содержать по одному или самое большее по два участка, разрезаемые той или иной рестриктазой; эти участки используются для встраи­вания в векторы чужеродной ДНК; поэтому они могут находиться в любых районах вектора (в том числе и в составе маркерного гена), но не в области, ответ­ственной за начало репликации вектора (иначе после встраивания чужеродной ДНК этот участок будет «ис­порчен» и вектор не сможет размножаться в клетке).

Вы, вероятно, поняли, что плазмиды и ДНК бакте­риофагов — прекрасные кандидаты в векторы. Но пока еще только кандидаты, а не сами векторы. Первому требованию они удовлетворяют полностью (как вы знаете, они прекрасно реплицируются в клетках неза­висимо от хромосомы). Но для того чтобы они удовлет­воряли второму и третьему требованию, над ними нуж­но еще поработать, довести до кондиции. Во-первых, ввести в них дополнительные маркерные гены (ДНК бактериофагов сама по себе, как правило, таких генов вообще не содержит). Во-вторых, природные плазмиды и фаговые ДНК порой содержат слишком много участков разрезания данной рестриктазой, к тому же в участках, ответственных за репликацию ДНК. От­мечаются случаи, когда, напротив, в ДНК нет нужного участка узнавания рестриктазой. Вот почему генный инженер перестраивает вектор.

Решить названные проблемы помогают те же рестриктазы и другие ферменты, применяемые для встраи­вания ДНК в векторы. Мы уже описали случай, когда слиянием двух плазмид, каждая из которых несла по одному гену устойчивости к антибиотику, был получен вектор с двумя маркерными генами. Кроме генов, де­лающих клетку устойчивой к воздействию антибио­тика, используются и другие маркерные гены. Очень популярным оказался первый ген лактозного оперона кишечной палочки (см. главу 2), в котором закоди­рован фермент 6-галактозидаза. Мы уже рассказывали, что этот фермент расщепляет дисахарид лактозу и ее аналоги. В качестве аналога можно взять вещество 5-бром-4-хлор-3-индолил- β-галактозид, которое генети­ки назвали Х-гал. β-Галактозидаза отщепляет от него бромхлориндол — краситель ярко-голубого цвета. Те­перь представьте себе, что в клетку кишечной палоч­ки (или какой-то другой бактерии), лишенной нор­мального гена 6-галактозидазы, ввели вектор с этим геном. Если в твердую среду, на которой растут клетки, добавить «Х-гал», то клетки с вектором бу­дут давать колонии, окрашенные в голубой цвет. Их очень легко отличить от исходных, бесцветных коло­ний.

На этом достоинства «голубого» вектора не конча­ются: если встроить в векторный ген 6-галактозидазы интересующий нас ген А, расчленив его на две части геном А, лишив возможности продуцировать активный фермент, и полученной рекомбинантной ДНК вновь трансформировать клетки кишечной палочки, то клетки с рекомбинантной ДНК дадут светлые колонии; их теперь легко отличить от клеток (голубых) с исходным вектором (рис. 25).

Использование гена Бета-галактозидазы для клонирования генов

Использование гена Бета-галактозидазы для клонирования генов

Лишние рестриктазные участки из векторов убирают с помощью делеций. Делеция — это удаление одной, нескольких или даже очень большого числа нуклеотид­ных пар (т. е. целого протяженного участка) из мо­лекулы ДНК. Существует множество способов вызвать делецию, и задача уменьшения числа участков, разре­заемых рестриктазами, большой трудности не представ­ляет.

А что делать, если в нужном районе вектора нет необходимого участка узнавания рестриктазой, дающей «липкие» концы? Для этого химическим синтезом по­лучают короткий фрагмент ДНК, содержащий необ­ходимую последовательность. Подбирают рестриктазу, которая разрезает вектор в нужном районе, и ДНК-лигазой вшивают туда синтетическую ДНК. Ее называют линкером — связкой (от английского слова — связывать). Часто линкер делают таким, чтобы в нем содержались последовательности сразу для нескольких разных рестриктаз (его называют полилинкером).

Итак, вектор создан. В него встроены фрагменты ДНК, среди которых находится интересующий нас ген. Клетки, в которые попал вектор, теперь можно легко от­личить от исходных клеток. Более того, в некоторых слу­чаях можно отличить клетки с векторами, в которые встроены фрагменты ДНК (т. е. рекомбинантные ДНК), от клеток с исходным вектором.

«Библиотеки» генов. Важно иметь в виду, что генные инженеры векторами всегда трансформируют клетки так, чтобы в одну клетку попала только одна моле­кула вектора. Поэтому дальше речь пойдет о поиске в сложной популяции клеток с рекомбинантными ДНК одной клетки с нужным геном.

Рассмотрим конкретный пример.

Как только возникла генная инженерия, генетики по­спешили осуществить свою давнюю мечту: иметь в рас­поряжении так называемые библиотеки генов различ­ных организмов. В современном понимании «библиоте­ка» генов (генотека) означает набор одинаковых векто­ров, в которые встррены фрагменты хромосом некоего организма, в совокупности представляющие весь геном этого организма.

Оказалось, что удобнее всего создавать такие биб­лиотеки с помощью векторов, полученных из ДНК фа­га XМы не напрасно в предыдущей главе подробно рассказали об этом умеренном фаге (его ДНК способна встраиваться в хромосому хозяйской клетки). Сначала в ДНК Х-фага выявили область, которую можно видо­изменять и даже целиком заменять на совсем другую ДНК, не нарушая ее репликацию. Эта область располо­жена в центре линейной формы фаговой ДНК и состав­ляет примерно треть длины всей молекулы. Затем из ле­вой и правой частей фаговой ДНК удалили места, по которым действуют наиболее часто употребляемые рестриктазы. Например, из пяти мест для рестриктазы Есо RI было оставлено всего два, но таких, которые позво­ляют вырезать из ДНК центральный район. Теперь, со­единив концы ДНК, получим ее циклическую форму. Век­тор готов к работе.

Предположим, что перед нами стоит задача получить библиотеку генов мыши. Для этого нужно выделить сум­марную ДНК из любого органа мыши, например из пече­ни (обычно любая соматическая клетка несет весь набор генов данного организма, исключения редки), и обрабо­тать ее рестриктазой EcoRI в условиях частичного рас­щепления.

О том, что такое частичное расщепление, мы расска­зали в главе 3. Почему именно частично, а не полностью следует расщеплять ДНК при получении «библиотеки» генов? Рассмотрим сегмент ДНК, в котором есть три места для рестриктазы EcoRI. Некий ген А может быть расположен в ДНК так, что один из рестриктазных разрывов расчленит его на две части. Следовательно, если полностью расщепить этот сегмент ДНК, то невозможно будет получить целый ген А. В условиях же частичного расщепления, когда образовываются, например, фраг­менты 1—2, 2—3, 3—4, 1—2—3, 2—3—4, в двух фраг­ментах 1—2 и 1—2—3 этот ген сохранится полностью (рис. 26).

Схема частичного расщепления ДНК с тремя участками, специфичными к рестриктазе...

Схема частичного расщепления ДНК с тремя участками, специфичными к рестриктазе…

На следующем этапе из векторной ДНК фага λ вы­резают центральный район (разумеется, той же рестрик­тазой EcoRI) и смешивают ее с EcoRI — фрагментами ДНК мыши так, чтобы липкие концы склеились. Фраг­менты сшивают с вектором и такими рекомбинантными ДНК трансформируют клетки кишечной палочки (в этом случае вместо термина «трансформация» обычно употребляют термин «трансфекция» — гибрид трансфор­мации и инфекции: ведь речь идет о заражении клет­ки геномом бактериофага).

Так проводят частичное расщепление ДНК мыши рестриктазой, то встроенные в ДНК фага λ фрагмен­ты будут иметь самые различные размеры: от несколь­ких сот до нескольких десятков тысяч пар оснований. Выбрать из такого широкого набора фрагменты опти­мальной длины такие, которые наверняка содержали бы неповрежденный ген и одновременно не были бы слишком большими (иначе их трудно будет анализиро­вать), помогает сам бактериофаг λКак видно из ри­сунка 27, размер ДНК, которая попадает в фаговые частицы, не может быть произвольным: он не должен быть намного короче или заметно длиннее, чем ДНК обычного фага XЗначит, если размер удаляемого из вектора центрального района составляет около 14 тыс. пар оснований, то примерно такую же длину будут иметь фрагменты чужеродной ДНК в фаговых частицах (что­бы общая длина рекомбинантного генома в них была рав­на примерно 45 тыс. пар оснований).

Схема конструирования "библиотеки" генов мыши на базе бактериофага...

Схема конструирования “библиотеки” генов мыши на базе бактериофага…

Исходя из этого, можно рассчитать, сколько нужно иметь в «библиотеке» фаговых частиц, чтобы в ней с вы­сокой вероятностью (~99%) был представлен весь ге­ном мыши. Для генома млекопитающих, общая длина которого составляет ~3•109 пар оснований, эта вели­чина составляет примерно 1 млн. фаговых частиц. Если нас интересует какой-то определенный ген, в этом мил­лионе нужно суметь найти одну частицу, в ДНК кото­рой нужный ген встроен.

Как из миллионов генов выбрать единственный. Генные инженеры не оперируют с отдельными генами и отдельными фаговыми частицами. Они манипулируют с миллионными популяциями, преследуя цель выявить потом нужную комбинацию из ненужных.

Главное, что нужно иметь для такого поиска (теперь часто пользуются словом «скрининг»), это зонд — мо­лекула РНК или ДНК (обязательно меченная радиоак­тивным изотопом, обычно фосфором 32Р), компле­ментарная нуклеотидной последовательности искомого гена.

Зонд можно синтезировать, если известна нуклеотидная последовательность (здесь надо вспомнить, что один ген отличается от другого прежде всего последователь­ностью нуклеотидных остатков) хотя бы небольшого участка гена или белка, который в нем закодирован. По аминокислотной последовательности с помощью гене­тического кода можно, казалось бы, легко воспроизвести нуклеотидную последовательность, ее кодирующую. Но нужно помнить, что код вырожден, и потому вместо одной последовательности получаются несколько ее вариан­тов. Поэтому из известной последовательности белка вы­бирают такой участок, где есть метионин и триптофан (у них только по одному кодону), и такие аминокислоты, для которых код вырожден в наименьшей степени. Если это сделать не удается, то приходится синтезировать се­рию зондов. Ведь вырожденность кода может привести к тому, что один и тот же аминокислотный текст оказы­вается закодированным в ДНК совершенно несходными нуклеотидными последовательностями. Например, сер-сер-сер-арг-ала в ДНК может читаться как AGTAGAGCACGA и как TCATCGTCTCGC.

Зондом может быть и РНК, выделенная тем или иным способом из клетки. Это зонд, который «дарит» генным инженерам сама природа: ведь иРНК комплементарна гену. Часто оказывается полезным получить ДНК — ко­пию (кДНК) этой иРНК с помощью образной транскрип­тазы.

Остановимся на операции получения ДНК-копий не­сколько подробнее: при клонировании генов к ней при­ходится прибегать не только для получения зондов, но и во многих других случаях.

Любая информационная РНК эукариот на 3′-конце содержит поли-А-последовательность — участок из не­скольких десятков монотонно повторяющихся остатков адениловой кислоты. Эта последовательность не зако­дирована в ДНК, а присоединяется к иРНК после окон­чания ее синтеза с помощью специального фермента, напоминающего 3′-терминальную полинуклеотидтрансферазу. И хотя роль поли-А-последовательности в функ­ционировании иРНК еще не вполне ясна (по некоторым данным, она делает иРНК устойчивой к нуклеазам ци­топлазмы), ее присутствие именно на 3′-конце этих мо­лекул оказалось как никогда кстати.

Во-первых, с помощью поли-А-последовательности иРНК можно отделить от остальных клеточных РНК (рибосомных, транспортных и прочих, составляющих бо­лее 90% всей РНК клетки), у которых такой последова­тельности нет. Для этого раствор суммарной клеточной РНК пропускают через колонку, заполненную целлюло­зой, с пришитым к ней полимером из тимидиловых Т-остатков. Информационные РНК связываются с носи­телем, а все другие РНК, не имеющие «хвоста» из поли-А, остаются в растворе. Колонку тщательно промывают растворителем, а затем связи А-Т разрушают нагрева­нием или повышением рН и вымывают фракцию иРНК.

Во-вторых, именно поли-А-последовательность на 3′-конце иРНК позволяет легко получить ее ДНК-ко­пию. Для этого поли-А-конец иРНК гибридизируют с олиго(Т)-затравкой (см. рис. 28) и с помощью обрат­ной транскриптазы (ревертазы) на РНК как на матрице получают ДНК-нить. Далее уже с помощью обычной ДНК-полимеразы (после разрушения РНК-цепи) полу­чают вторую цепь ДНК. В качестве затравки ДНК-полимераза использует образующуюся на 3′-конце пер­вой ДНК-цепи шпильку, т. е. двуспиральный участок. Поэтому у двуцепочечной кДНК обе цепи оказывают­ся связанными друг с другом. Их разрезают с помощью нуклеазы, специфичной к однотяжевой ДНК.

Получение ДНК с помощью обратной транскриптазы

Получение ДНК с помощью обратной транскриптазы

Обычно таким способом удается скопировать толь­ко часть иРНК (даже если обратная транскриптаза «прочтет» всю иРНК, часть кДНК будет потеряна при образовании шпильки). Однако в качестве зонда та­кая укороченная кДНК вполне пригодна.

Из очень небольшого количества иРНК можно по­лучить большие количества кДНК-зонда. Для этого к кДНК пришивают линкерные участки, переносят ее в векторную плазмиду, которую размножают в соответст­вующих клетках в нужном количестве.

Имея зонд, можно приступать к анализу рекомбинантных фаговых частиц. Для этого бактерии, среди ко­торых есть зараженные фагом, выращивают на твердой среде в чашках Петри, как говорят микробиологи, по­лучают газон бактерий. В тех местах, где проявилась фаговая инфекция на газоне, будут наблюдаться про­зрачные бляшки. Напомним, что в том месте, где обра­зовалась бляшка, клетки кишечной палочки разрушены и вся ее площадь заполнена остатками клеток, фаговы­ми частицами и свободной ДНК бактериофага. Эта ДНК синтезировалась в клетке хозяина, но не успела одеть­ся фаговыми белками. Именно за ней и пойдет охота.

Давно замечено, что ДНК очень хорошо сорбируется на нитроцеллюлозе (бездымном порохе). Если из этого материала изготовить фильтр (похожий на обычный бу­мажный фильтр) и пропустить через него раствор ДНК, то ДНК задержится на фильтре так, словно была не в растворенном виде, а в виде осадка. Такие нитроцеллю­лозные фильтры широко используют для поиска реком­бинантных ДНК с необходимыми генами.

Если нитроцеллюлозным фильтром прикоснуться к газону бактерий с бляшками, то молекулы ДНК как бы прилипнут к фильтру (сорбируются на нем). Необходи­мо с большой точностью отметить положение фильтра относительно газона (например, иглой проткнуть фильтр и находящийся под ним агар с газоном в нескольких местах). Далее фильтр быстро обрабатывают 0,5 н NaOH, затем нейтрализуют. Такая обработка приводит к тому, что цепи двуспиральной ДНК разделяются и она пере­ходит в денатурированное состояние, в котором креп­че связывается с нитроцеллюлозой. Остается только «на­вечно» закрепить такую ДНК на фильтре. Для этого фильтр вместе с ДНК прогревают при 80° С.

Отметьте, что положение зоны с молекулами ДНК на фильтре (маленькое пятнышко) точно соответству­ет положению определенной фаговой бляшки на газо­не, т. е. на поверхности твердой среды с проросшими ко­лониями.

Следующий шаг: обработка фильтра раствором ра­диоактивного зонда — полинуклеотида, комплементар­ного искомому гену. В основе этой процедуры лежит образование ДНК — ДНК или ДНК — РНК гибрида. Поэтому зонд должен быть в однотяжевой форме, а условия обработки оптимальными для гибридизации: повышенная температура (но не слишком высокая, что­бы образовавшиеся гибриды снова не разрушались), длительное время (чтобы зонд успел найти свою ДНК). По окончании процедуры гибридизации фильтр отмы­вают от избытка зонда (иначе лишняя кДНК или иРНК, «прилипнув» к фильтру, образуют сильный радиоактив­ный фон, скрывающий результаты). Теперь та ДНК, в которой находится искомый ген, связавшись с зондом, несет на себе метку в виде радиоактивного фосфата. Выявить положение ее зоны сравнительно просто: фильтр в темноте накладывают на обычную рентгеновскую фо­топленку, после необходимой экспозиции (ее время определяется величиной радиоактивности) фотопленку проявляют. Зона с радиоактивной ДНК выглядит на пленке как маленькое темное пятнышко. Эта процеду­ра называется радиоавтографией. Зная, где это пятныш­ко находится на фильтре, можно найти на газоне бляш­ку, в которой находится фаг с искомой рекомбинант­ной ДНК (рис. 29). Остается только размножить его в культуре клеток кишечной палочки, выделить из него ДНК и из этой ДНК вырезать вставку той же рестрик­тазой EcoRI. Эта вставка — индивидуальный фрагмент одной из хромосом мыши, содержащий нужный ген! Еще недавно этот фрагмент был спрятан среди мил­лиона, казалось бы, ничем не отличающихся друг от друга фаговых частиц, и вот теперь он в руках исследо­вателей.

Схема опыта по обнаружении колоний бактерий, несущих искомый ген, с помощью радиоактивного зонда

Схема опыта по обнаружении колоний бактерий, несущих искомый ген, с помощью радиоактивного зонда

Сегмент ДНК с интересующим нас геном обычно по длине в несколько раз больше самого гена (помните, фа­говый вектор сконструирован так, чтобы величина кло­нируемой ДНК была 15—20 тыс. пар нуклеотидов, а средняя длина гена — 1—2 тыс. пар нуклеотидов). Вот почему работа по получению индивидуального гена на этом не заканчивается. Помогут изолировать ген все те же рестриктазы и тот же зонд, который был использо­ван для скрининга «библиотеки» генов.

Сегмент ДНК, извлеченный из «библиотеки» генов, расщепляют различными рестриктазами, получающие­ся фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле. Дальнейшая задача состоит в том, чтобы опре­делить, в какой из электрофоретических зон находится нужный ген. Перенесем ДНК из этих зон на нитроцел­люлозный фильтр. Для этого сразу после окончания электрофореза на пластинку агарозного геля, еще про­питанного раствором электролита, накладывают нитро­целлюлозный фильтр, а сверху на него кладут несколь­ко листов толстой фильтровальной бумаги, и все это помещают под пресс. Фильтровальная бумага будет вса­сывать в себя раствор из геля, но по дороге он прохо­дит через фильтр, и ДНК, увлекаемая растворителем и вымывающаяся из электрофоретических зон, задер­жится на фильтре. Ее положение на фильтре точно со­ответствует положению на электрофоретической плас­тинке. Таким образом получен отпечаток картины элек­трофореза на нитроцеллюлозном фильтре. Эту опера­цию называют блоттингом (от английского слова — про­мокательная бумага).

Все остальные операции осуществляются так же, как и при скрининге «библиотеки» генов: ДНК на филь­тре денатурируют, затем на нем необратимо закрепля­ют прогревом и гибридизуют ее с зондом. Те зоны ДНК, которые содержат искомый ген (или его фрагменты), свяжутся с радиоактивной меткой. Их обнаруживают радиоавтографией. Легко сообразить, что радиоактив­но меченными могут оказаться сразу несколько зон ДНК, а не одна, хотя мы имеем дело с индивидуальным геном: рестриктазы могут разрезать этот ген на части и он по­падет в разные фрагменты ДНК, отличающиеся по раз­меру. Совмещая радиоавтограф с электрофореграммой, теперь точно можно установить, в какой части «библио­течного» сегмента ДНК находится интересующий нас ген.

Остается только этот ген размножить. (Многие из вас могут сообразить, как это сделать.) Однако доведем объяснение до конца. Воспользуемся плазмидным век­тором, который носит название pBR322. Наверное, это самый популярный вектор у генных инженеров. Он со­держит сразу два гена устойчивости к антибиотикам — тетрациклину и ампициллину (родственнику обычного пенициллина). В составе этих генов есть по нескольку участков узнавания различными рестриктазами, при­чем каждый из таких участков уникален, т. е. встреча­ется в векторе только один раз.

Теперь из рестрикционных фрагментов ген выберем такой, в котором нужный ген содержится целиком, но размеры которого не слишком превышают длину само­го гена. Такой выбор помогает сделать вдумчивый ана­лиз картины гидролиза «библиотечного» сегмента ДНК различными рестриктазами, полученной на предыдущем этапе. Допустим, что подходящий фрагмент есть и он получается при расщеплении сегмента из «библиотеки» генов рестриктазой BAmHI. В плазмиде pBR322 уча­сток разрезания (последовательность GGATCC) этой рестриктазой находится в гене устойчивости к тетра­циклину. Разрежем плазмиду BamHI, встроим в нее вы­бранный фрагмент и трансформируем такой рекомбинантной ДНК кишечную палочку. Последующий путь отбора клеток с рекомбинантной ДНК ясен: исходные клетки (без вектора) чувствительны как к тетрацикли­ну, так и к ампициллину, клетки с неизменным векто­ром растут в присутствии обоих антибиотиков, а клетки с рекомбинантным вектором (т. е. с нашим геном) толь­ко в присутствии ампициллина. Замечательное свойст­во плазмиды pBR322 заключается в том, что она, как говорят, мультикопийна, т. е. в каждой клетке можно получить несколько десятков (а в специальных усло­виях и несколько сот) молекул рекомбинантной ДНК. Обычно отклонированный этим способом ген так и хра­нят в составе плазмиды, которая в любой момент мо­жет быть размножена в клетке. Плазмида стабильна, и ее даже можно послать письмом по почте своему кол­леге, запечатав в маленький пластиковый пакетик.

Как заставить ген работать на новом месте. На при­мере поиса нужного гена в «библиотеке» генов мы по­знакомились со многими основными приемами генной инженерии. Однако картина была бы далеко не полной, если бы мы не рассказали о том, как при клонировании генов используется способность этих генов экспресси­роваться (выражаться, т. е. синтезировать иРНК и бе­лок) в чужеродной клетке.

Сама проблема синтеза белков с помощью чужерод­ных генов, например генов человека в кишечной палоч­ке, далеко не простая. И важна она не столько для от­бора клеточных клонов с нужным геном, сколько, как вы увидите дальше, для получения необходимых чело­веку белков в быстрорастущих клетках микроорганиз­мов.

Вспомним, что под экспрессией гена понимается син­тез на этом гене предшественника иРНК (т. е. полно­ценная его транскрипция), процессинг иРНК (т. е. пре­вращение ее в зрелую иРНК) и трансляция этой иРНК (синтез белка с помощью РНК-матрицы на рибосомах). К этому нужно добавить, что образующийся белок дол­жен быть устойчив в чужеродной клетке. Кроме того, часто требуется, чтобы белок после образования в цито­плазме клетки был транспортирован (или, как говорят, секретирован) через клеточные мембраны наружу клет­ки. Для этого на его N-конце должна содержаться спе­циальная последовательность, обладающая сродством к клеточным мембранам. А ведь клетки прокариот и эукариот (в нашем случае кишечной палочки и челове­ка) используют совершенно разные сигналы транскрип­ции, трансляции, процессинга и транспорта белков.

Многие белки эукариот после завершения синтеза полигликозилируются: к белку пришивается короткая цепочка полисахарида, что сказывается на их активно­сти и на их транспорте внутри клетки. Более того, не за­бывайте, что многие гены эукариот в отличие от прокариотических генов состоят из экзонов и интронов, а сис­темы ферментов сплайсинга, которые бы удалили интроны и правильным образом сшили друг с другом экзоны, в кишечной палочке нет.

Отметим, что последняя трудность разрешается срав­нительно легко: достаточно получить полноразмерную ДНК-копию (кДНК) зрелой информационной РНК, из которой уже удалены интроны. Что же касается различ­ных сигнальных последовательностей, то здесь можно пойти двумя путями.

Во-первых, можно снабдить эукариотический ген всеми необходимыми сигналами прокариотической клет­ки. Эти сигналы (промоторы, терминаторы, сигналы транспорта) в виде фрагментов ДНК генные инженеры всегда держат под рукой. Единственное, что сделать по­ка не удается, это гликозилировать белки в бактериаль­ной клетке. К счастью, многие белки (например, интер­ферон) обладают активностью и без полисахаридной привески. Если же такая модификация все же необхо­дима, то вместо бактериальной клетки придется помес­тить ген в клетки животных, о чем речь пойдет дальше.

Во-вторых, чтобы обеспечить экспрессию чужого ге­на в клетках кишечной палочки, можно сшить его с ка­ким-нибудь геном этой клетки. Создавая генетические конструкции этим способом, генные инженеры предпо­читают использовать ген 8-галактозидазы, о котором не раз уже говорилось. Вот, например, как был полу­чен продуцент белка, из которого можно наработать один из гормонов человека — соматостатин! (Подробнее об этом гормоне расскажем в следующей главе.)

Соматостатин — это даже не белок, а полипептид: он состоит всего из 14 аминокислотных остатков. Это значит, что его ген имеет длину 42 нуклеотидных остат­ка. На самом деле был получен более длинный двутя­жевой полинуклеотид, состоящий из 52 нуклеотидных остатков, так как к гену нужно было присоединить «лип­кие» рестриктазные концы. Кроме того, как видно на ри­сунке, в начало этого гена был вставлен также кодон AUG (на языке ДНК—ТАС). Этот кодон соответствует аминокислоте метионину. Синтетический ген соматоста-тина был встроен в плазмидный вектор так, чтобы он ока­зался «в хвосте» гена 8-галактозидазы (который за­ранее был помещен в тот же вектор вместе со всеми не­обходимыми сигналами). Такой рекомбинантный ген 8-галактозидазы после трансформации вектором кишеч­ной палочки прекрасно в ней экспрессировался: ведь он был в своей родной стихии, а белок, который при этом получался, представлял собой гибрид, или химеру, 8-галактозидазы и соматостатина. Его выделили, и те­перь предстояло отделить гормон от фермента (рис. 30). Вот здесь и был использован остаток метионина, допол­нительно вставленный в химеру при конструировании ее гена. Простое химическое соединение — бромциан (BrCN) — расщепляет белки по метионину. А так как в самом соматостатине метионина нет, то гормон после обработки химеры бромцианом получается в неповреж­денном виде.

Получение человеческого гормона соматостатина в клетках кишечной палочки

Получение человеческого гормона соматостатина в клетках кишечной палочки

Есть и другие варианты получения химер. Модно, например, из хозяйского белка оставить только несколь­ко первых (N-концевых) аминокислотных остатков, за­то использовать все его сигнальные последовательности. Такой небольшой привесок, как правило, на активности белка не сказывается.

Итак, теперь мы знаем, как добиться того, чтобы клет­ка, получив чужеродный ген, производила закодирован­ный в нем белок. Вернемся же к технике клонирования генов и посмотрим, как это обстоятельство может быть использовано для селекции клеток, несущих интересую­щий нас ген.

Самый простой случай — это когда ген кодирует бе­лок, который сама клетка не производит, но без этого белка расти не может. Например, если белок — продукт нашего гена — участвует в биосинтезе аминокислоты гистидина, нужно взять клетки — ауксотрофы — по гис-тидину. Трансформируем эти клетки вектором с нашим геном и будем выращивать их на среде без гистидина. Вырастут на такой среде только те клетки, которые со­держат вектор с искомым геном. Они и станут источни­ком для его получения.

Удобно отбирать клоны с неким индивидуальным ге­ном, когда продукт этого гена имеет ярко выраженную биологическую активность. Например, фермент, актив­ность которого может быть определена с помощью како­го-либо чувствительного метода. Выше мы говорили об отборе голубых колоний кишечной палочки, синтезирую­щей 8-галактозидазу, с помощью «Х-гал». А вот дру­гой пример. Вам, наверное, приходилось наблюдать лет­ней южной ночью светлячков. Светятся они благодаря специальному органу, в котором вырабатывается фер­мент люциферин-люцифераза. Этот фермент в присут­ствии универсального аккумулятора энергии — адено­зинтрифосфата (АТФ) — образует вещество с сильной люминисценцией (кстати, благодаря такой активности люциферин-люциферазу широко используют для опреде­ления концентрации АТФ в биологических объектах). Ген люциферин-люциферазы удалось недавно отклони­ровать в клетках кишечной палочки, причем колонии бактерий с этим ферментом светились как светлячки и их отбирали по этому признаку.

Еще один очень эффективный способ отбора коло­ний основан на иммунологических тестах. Обычно его применяют тогда, когда клонируют ген уже достаточно хорошо известного белка, на который можно вырабо­тать антитела. Впервые этот метод был применен для отбора клонов кишечной палочки, содержащих ген ин­сулина (точнее гены: ведь инсулин, хотя и маленький белок, состоит из двух полипептидных цепей, соединенных S—S-связями). Почему гены инсулина пришлось переносить в бактериальную клетку, вы узнаете в дру­гой главе. А сейчас на этом примере давайте рассмотрим суть иммунологического метода отбора клонов.

Векторы с генами инсулина были сконструированы уже знакомыми нам методами. После того как бактерии, трансформированные этими векторами, вырастили на чашках Петри, с них получили реплики. Однако на этот раз нитроцеллюлозные фильтры заменили на пластинки из поливинилхлорида, к которым были пришиты антите­ла к инсулину. Клетки, содержавшие векторы с геном инсулина, не только синтезировали этот гормон, но и секретировали его. Поэтому в тех местах, где находились такие колонии, был и свободный инсулин. Он прилипал к антителам, закрепленным на полимере. Обнаружива­ли положение этих прилипших молекул инсулина вновь с помощью антител, но уже меченных радиоактивным иодом 125J так, как это изображено на рисунке 31. Так же, как и 32Р, радиоактивную иодную метку можно об­наружить на рентгеновской пленке посредством радио­автографии. По положению радиоактивных зон на по­лимерной пластинке можно установить местоположе­ние колоний бактерий с активным геном инсулина. Эти клетки стали затем прародителями промышленных про­дуцентов инсулина.

Схема поиска бактериальных клеток, синтезирующих инсулин человека, с помощью антител

Схема поиска бактериальных клеток, синтезирующих инсулин человека, с помощью антител

Клонирование генов в клетках эукариот. До сих пор мы рассматривали клонирование генов в бактериаль­ных клетках, в том числе и тех генов, которые были из­влечены из хромосом эукариот. А нельзя ли научиться переносить рекомбинантные ДНК прямо в эукариоти­ческие клетки и там заставить их экспрессироваться?

Вопрос этот имеет огромное практическое значение: ведь если мы действительно рассчитываем направлен­но создавать новые виды растений и животных, если хо­тим активно бороться с генетическими заболеваниями человека, то должны уметь включать в геном высших организмов гены, сконструированные вне клетки. В по­следующих главах вы познакомитесь с первыми успе­хами генной инженерии растений и животных. А сейчас коротко рассмотрим векторные системы, которые уда­лось создать для переноса рекомбинантной ДНК в эука­риотические клетки.

Техника встраивания генов в эукариотические векто­ры и их клонирования в принципе та же, что и в случае бактериальных клеток. Однако сами эукариотические векторы отличаются от бактериальных. Конечно, они также имеют удобные участки для разрезания рестрик­тазами и маркерные гены. Но создают их на базе геномов плазмид и вирусов эукариот: им предстоит репли­цироваться в эукариотической клетке и они должны быть приспособлены к ферментам и факторам, управ­ляющим репликацией ДНК в таких клетках. Кроме то­го, в случае эукариот часто нужно стремиться к тому, чтобы чужеродный ген встроился (интегрировал) в хро­мосому клетки — реципиента. Тогда эукариотические векторы приходится снабжать элементами, обеспечиваю­щими такое встраивание.

Начнем с простейшего эукариота — дрожжей. Дрож­жи — это низшие одноклеточные грибы. По всем при­знакам это настоящие эукариоты: у них есть ядро, отде­ленное от цитоплазмы ядерной оболочкой, а весь фер­ментативный аппарат репликации ДНК, транскрипции и трансляции у них практически такой же, как и у осталь­ных эукариот. У дрожжей работают ферменты — глико-зилирующие белки. В то же время дрожжи быстро рас­тут, используя даже такие субстраты, как парафин и ме­тиловый спирт. Они уже давно стали промышленными микроорганизмами, их умеют прекрасно выращивать в заводских условиях. Они безопасны для человека и рас­тут на дешевой среде. Следовательно, дрожжи очень перспективный объект для промышленного производ­ства ценных продуктов любых эукариотических генов. Кроме того, геном дрожжей не так уж велик — 1,7Х10пар нуклеотидов на гаплоидную клетку (сравните с ЗХ109 пар нуклеотидов в геноме человека). А главное, он досконально изучен генетиками.

Правда, один недостаток у дрожжевых клеток есть: они покрыты очень плотной клеточной оболочкой, совер­шенно непроницаемой для молекул ДНК. Но здесь на помощь приходит обыкновенная виноградная улитка. Она вырабатывает ферменты — 8-глюконазы, разру­шающие полисахариды, из которых построена клеточ­ная стенка дрожжей. 8-глюконазы превращают дрож­жи в «раздетые клетки» — так называемые протопласты, у которых цитоплазма окружена уже только тонкой, легкопроницаемой мембраной. Их обычно и трансфор­мируют рекомбинантными ДНК. Важно, что через неко­торое время стенка у дрожжевой клетки восстанавли­вается и рекомбинантная ДНК оказывается включенной в полноценную клетку.

Многие штаммы дрожжей содержат плазмиду — циклическую ДНК длиной 2 мкм (6300 пар нуклеотидов). Ее так обычно и называют — «плазмида 2 мкм». Она мультикопийна: клетка дрожжей может иметь до 100 ее копий. Однако, чтобы превратить ее в вектор, при­шлось изрядно потрудиться: вставить в нее маркерные гены (в самой плазмиде 2 мкм их нет), убрать лишние рестрикционные участки и сохранить при этом ее способ­ность реплицироваться в клетках дрожжей.

Из плазмиды 2 мкм получено уже множество векто­ров. Пожалуй, самые интересные из них получили на­звание челночных векторов. Эти векторы могут реплици­роваться не только в клетках дрожжей, но и в клетках кишечной палочки благодаря тому, что в них встроили фрагменты плазмид бактерий, содержащие бактериаль­ные маркеры, а главное — участки, ответственные за их репликацию. С помощью таких «челноков» можно кон­струкции, созданные в бактериальной клетке, перено­сить в дрожжи и наоборот. Более того, некоторые «чел­ноки» устроены так, что вместе с содержащимися в них генами могут включаться в хромосомы дрожжей. Таким образом, гены, отклонированные в кишечной палочке, удается не только размножать в дрожжах, но и «навеч­но» встраивать в дрожжевой геном.

Понятно, что для нормальной экспрессии чужерод­ных генов в дрожжах они должны быть снабжены дрож­жевыми (эукариотическими) сигналами транскрипции и трансляции. Эту задачу также научились решать; сей­час получены дрожжи, продуцирующие интерфероны че­ловека, необходимый для сыроварения химозин, инсу­лин и многие другие полезные белки.

Рассмотрим теперь более сложный пример — пере­нос рекомбинантных ДНК в клетки высших эукариот. Пока исследования здесь ведут, как правило, не на це­лых организмах, а на культурах клеток животных. Сей­час такие клетки, например клетки тканей человека, успешно размножают в жидкой и твердой среде, почти так же как бактерии и грибки. Правда, в культуре они гораздо капризнее. Лучше всего они растут, если в сре­ду добавлять сыворотку крови теленка, богатую белком фетуином (а-глобулином). Лишь недавно разработа­ны почти полностью синтетические среды, содержащие полный набор аминокислот, витамины, ростовые факто­ры, соли и глюкозу. Белки — сывороточный альбумин и фетуин — все же приходится добавлять.

В таких средах удается выращивать клоны клеток, полученных из эмбриональных тканей и органов челове­ка (из кожи, мышц, легких, почек, сердца, тимуса и дру­гих желез), 5—8 месяцев. За это время они проделы­вают до 50 делений, а затем по еще неясным причинам перерождаются и дегенерируют. Исключение составля­ют клетки злокачественных, раковых опухолей. Они об­ладают секретом «вечной молодости», и большинство их клонов существует годами. Раковые клетки отлича­ются от нормальных еще и тем, что на поверхности твер­дой среды они образуют скопления в несколько слоев. Нормальные клетки на поверхности среды образуют слой в одну клетку (монослой). Это свойство опухолевых кле­ток «клеточные инженеры» научились использовать при создании так называемых гибридом, о которых еще пой­дет речь.

Самый популярный объект для изготовления векто­ров для клеток животных — вирус SV40. Это малень­кий вирус с кольцевой ДНК, длиной примерно в 5250 пар нуклеотидов, который был выделен из почки мартышки (отсюда название simian virus(SV) — обезьяний). Для человека он неопасен, он может вызывать раковые за­болевания у обезьян. Кроме того, в определенных усло­виях вирус SV40 вызывает онкогенную трансформацию (т. е. превращение нормальных клеток в раковые) мно­гих культивируемых клеток животных, например золо­тистого хомячка. Как источник для конструирования векторов геном вируса SV40 привлек внимание потому, что он прекрасно реплицируется в ядре клетки. Кроме того, подобно бактериофагу λ он может встраиваться в хромосомы хозяйской клетки (такое встраивание и вызывает онкогенную трансформацию клетки).

Из ДНК вируса SV40 удалось сконструировать це­лую серию полезных векторов, в том числе и «челноковые» векторы, с помощью которых переносят в клетки животных гены, отклонированные в бактериях. Такой перенос особенно важен, если ген состоит из интронов и экзонов: ведь даже система сплайсинга дрожжей не­способна обеспечить образование нормальных белков животных.

Немало трудностей пришлось преодолеть, прежде чем научились переносить рекомбинантные ДНК в эукариотические клетки. Самый простой прием основан на спо­собности многих клеток поглощать с ДНК комплекс микрокристаллов фосфата кальция. Этим путем обычно проводят трансфекцию клеток векторами, полученными из ДНК вируса SV40. Более утонченный прием состоит в том, что ДНК заключают в так называемую липосому, т. е. в микрокапельку водного раствора ДНК, окружен­ную фосфолипидной оболочкой. Стенки клеток эукариот также содержат фосфолипидные слои. Поэтому липосо­мы сливаются с клетками, а их содержимое переходит вовнутрь клетки.

Благодаря тому что эукариотические клетки доста­точно велики, иногда удается тончайшим микрокапил­ляром, соединенным со шприцем, раствор ДНК впрыс­нуть прямо в их ядро или цитоплазму. Особенно хоро­шо техника микроинъекций разработана на яйцеклетках лягушек.

И наконец, переносить рекомбинантные ДНК, со­зданные из вирусных ДНК, можно с помощью самих ви­русов. Вирусы давно приспособились проникать из клет­ки в клетку, поражая большие участки тканей, целые органы или организмы. И как бы сложно ни был устроен вирус, после его проникновения в клетку вирусная ДНК освобождается от вирусной оболочки и реплицирует­ся в клетке. Вот тогда и можно подумать о том, как ис­пользовать вирусы для переноса полезных генов в мно­гоклеточные организмы, вплоть до растений, животных и человека.

Сейчас обнаружены ДНК-содержащие вирусы (ге­ном подавляющего большинства вирусов растений пред­ставлен РНК), паразитирующие на растительных клет­ках. Правда, они еще плохо изучены, и поэтому в ген­ной инженерии растений используют векторы другого типа, о которых мы специально расскажем, когда будем рассматривать проблему переноса азотфиксирующих генов (глава 8).

Конечно, далеко не все вирусы животных и челове­ка пригодны для переноса генов в эти организмы. Сле­дует помнить, что речь идет о возбудителях болезней, на­ших злейших врагах, многие из которых стимулируют раковые заболевания. Здесь вспомнили о вирусе осповакцины — живой вакцине, которая, казалось бы, уже отслужила свое, избавив человечество от одной из са­мых страшных болезней.

Вирус осповакцины имеет очень сложное строение. Его геном огромен по обычным вирусным масштабам: его длина 187 тыс. пар нуклеотидов. Создать векторы из такой огромной ДНК невозможно, да и нет особого смыс­ла, так как сама ДНК этого вируса не инфекционна. Оказалось, однако, что в клетке ДНК вируса осповакцины охотно рекомбинируется с любой другой ДНК, но обязательно несущей фрагменты вирусной ДНК. Эта чужеродная ДНК вместе с остальным вирусным гено­мом включается затем в вирусные частицы. При этом замещаться может очень большой сегмент вирусной ДНК — до 25000 пар нуклеотидов. Вот здесь и возник­ла замечательная возможность на основе вируса оспо-вакцины (совершенно безопасного для человека и жи­вотных, технология производства которого отлажива­лась десятилетиями) создать живую поливакцину, спо­собную избавить человечество от многих инфекцион­ных заболеваний. О первых успехах в этом направлении вы узнаете из следующих глав.

В завершение главы расскажем, почему один из творцов генной инженерии П. Лобан оставил микробиологию.

Историки науки сходятся во мнении, что П. Лобан был первым, кто теоретически создал полную схему получения рекомбинантных ДНК и клонирования генов. Произошло это так.

Во многих американских университетах аспиранты обязательно сдают своеобразный экзамен. Они должны разработать проект на­учного исследования, которое прямо не связано с темой их диссер­тационной работы. Но все в этом проекте: и его цель, и способы реализации — должно быть хорошо обосновано. Смысл такого эк­замена — выявление творческих способностей будущего ученого.

В качестве проекта П. Лобан предложил ту схему, которую мы подробно рассмотрели в этой главе (см. рис. 24). Его экзаменато­рами были выдающиеся ученые, а председателем экзаменационной комиссии — сам А. Корнберг, расшифровавший механизм биосин­теза ДНК и открывший ДНК-полимеразу. А. Корнберг был изум­лен, выслушав идею П. Лобана, и настоял на том, чтобы П. Лобан бросил прежнюю работу и принялся за реализацию своей идеи. Питер Лобан последовал совету знаменитого ученого.

Через несколько месяцев работы П. Лобан обнаружил, что в со­седней лаборатории П. Берг и его сотрудники работают над совер­шенно таким же проектом. Никакого плагиата здесь не было: П. Берг на экзамене П. Лобана не был и идея искусственного создания «лип­ких» концов пришла ему независимо. Группа (или, как любят гово­рить американцы, команда) П. Берга завершила работу раньше. Статья П. Берга также вышла на год раньше статьи П. Лобана. В ней П. Берг отдал должное своему младшему коллеге. Но кто пер­вым финишировал, тот и победитель.

П. Лобан тяжело переживал случившееся. Он решил оставить молекулярную биологию и заняться микропроцессорами.