5 месяцев назад
Нету коментариев

Снова мы начинаем с фотофизики: поглощенный квант переводит молекулу в электронно-возбужденное состояние; возбужденная молекула из синглетного со­стояния, время жизни которого около 10-11 с, может перейти в триплетное. Триплетное возбужденное состоя­ние молекулы существует достаточно долго, чтобы она успела провзаимодействовать с другой молекулой и ини­циировать фотохимическую реакцию.

Изомеризовавшийся ретиналь, еще связанный с бел­ковой частью родопсина или «перескочивший» на липид, способен инициировать в фоторецепторной мембране ре­акции фотоокисления.

Что понимает фотохимия под фотоокислением? Окис­лительно-восстановительными называют реакции, сопро­вождающиеся переносом одного или нескольких элек­тронов от одного из реагентов (восстановителя) к дру­гому (окислителю). Если в ходе фотохимической реак­ции молекула (субстрат окисления) отдает электрон, говорят, что она окисляется, другая же молекула, при­нимающая электрон, например кислород, восстанавли­вается. При прямом, несенсибилизированном фотоокис­лении возбужденная светом молекула, которая окисля­ется, реагирует с кислородом; она превращается в ка­тион-радикал, а кислород — в анион-радикал (суперок­сидный радикал).

Окисление родопсина и липидов в фоторецепторной мембране, как и большинство фотобиологических реак­ций окисления, фотосенсибилизированное. Различают два типа, два пути фотосенсибилизированного окисле­ния: первый — химическая сенсибилизация и второй — физическая сенсибилизация. Наша конкретная экспери­ментальная задача в настоящее время — определить возможный вклад каждого из них в механизм фотопо­вреждения зрительной клетки.

Первичная реакция в химической сенсибилизации — взаимодействие возбужденной светом молекулы сенси­билизатора (в нашем случае ретиналя) с субстратом окисления (с родопсином и липидом). Обозначим сенси­билизатор буквой S, а субстрат окисления — RH. Обра­зовавшийся свободный радикал (R) белка или липида присоединяет кислород. Далее развивается процесс окис­ления, который от света уже не зависит. Эта первичная световая реакция между сенсибилизатором и субстратом окисления есть не что иное (в терминах теории ценных процессов), как фотохимическое инициирование, или зарождение цепной реакции, в ходе которой из валентно-насыщенных исходных веществ образуются свободные радикалы.

Итак, S0 —» Sx, где S0 и Sx — сенсибилизатор в ос­новном и возбужденном состояниях, а дальше — хими­ческая сенсибилизация — Sx + RH — —» S — H + R, где (R) — свободнорадикальное состояние. Теперь следует R + O2 —» (RO2) — эта стадия в теории цепных реакций называется продолжением цепи. На этой стадии в ре­зультате взаимодействия свободного радикала R с мо­лекулярным кислородом О2 образуется новый свободный

радикал — перекисный RO2 (R может быть как радика­лом белка, так и липида). Перекисный радикал, взаимо­действуя с новой молекулой (RH), образует гидропере­кись (ROOH) RO2 + RH —» ROOH + R; и снова полу­чился R — свободный радикал, который принимал уча­стие в цепном процессе на предшествующей стадии и который повторяет все сначала.

В отличие от I типа — химической сенсибилизации, когда белок или липид взаимодействует с триплетным электронно-возбужденным сенсибилизатором, первичной реакцией в физической сенсибилизации (II тип) являет­ся сначала активация молекулы кислорода. Возбужден­ная молекула сенсибилизатора, отдавая энергию моле­кулярному кислороду (О2), переводит его из основного триплетного состояния в возбужденное синглетное. Об этих особенностях молекулярного кислорода уже шла речь.

Конечно, не так просто непосвященному человеку ра­зобраться в тонкостях современной фотохимической фи­зики. Поэтому мы сознательно возвращаемся к некото­рым фундаментальным положениям, вдаваясь в них все глубже и глубже. Иначе как рассказать о конкретных исследованиях и нерешенных задачах, о химической фи­зике проблемы «Глаз и Солнце»? Проблема эта не толь­ко захватывающе интересна, она крайне важна практи­чески. Методы и приборы современной офтальмологии в некоторых случаях несовершенны. Опасность повреж­дающего действия луча яркого видимого света, который врач слишком часто или надолго направляет в глаз больному, только в последнее время начинает осознаваться; завет Гиппократа «не повреди» иногда поневоле нарушается. Не менее остро стоит вопрос о вредящем действии света и на зрение здоровых людей.

Вернемся к синглетному кислороду. Время жизни высокореактивного синглетного кислорода зависит от окружающих его молекул растворителя и молекул-ту­шителей. Один из самых эффективных тушителей син­глетного кислорода, его дезактиваторов — р-каротин. Его роль в осуществлении нормального процесса фото­синтеза велика — он защищает растительную клетку от повреждающего действия синглетного кислорода. Белки при концентрациях свыше 1% взаимодействуют с сенсибилизаторами в электронно-возбужденном состоя­нии (I тип) или синглетным кислородом (II тип) исклю­чительно эффективно. Анализ кинетических данных по­казывает, что на первичной стадии фотоокисление прак­тически невозможно перехватить, остановить фотопора­жение. Это осуществимо лишь на последующих стадиях окисления.

Для нас насущная задача — выяснение путей фото­окисления ретиналя, родопсина и липидов в зрительной клетке. Обычно от правильного определения пути фото­окисления зависит выбор наиболее эффективных спосо­бов защиты от фотоповреждения (полимеров, биомакро­молекул или других соединений) или способов стимуля­ции, ускорения желательных фотохимических, фотобио­логических (например, фотоэнергетических) процессов. Проблема выяснения механизмов повреждающего дей­ствия света на зрение разрабатывается ИХФ АН СССР с начала 70-х годов.

Начнем с последнего: Может ли ретиналь сенсиби­лизировать фотоокислительные реакции? Были поставле­ны опыты на модельной системе ретиналь — белок (мо­дельным белком в них служил протеолитический фер­мент трипсин). Кинетическое исследование механизма сенсибилизированного ретиналем окисления трипсина было проведено с помощью фотохемилюминесценции.

Анализ кинетики фотохемилюминесценции позволил заключить, что ретиналь, поглощая свет, переходит в триплетное электронно-возбужденное состояние и вза­имодействует с кислородом, переводя его в синглетное состояние. В свою очередь, синглетный кислород ини­циирует образование первичных свободных радикалов белка трипсина, а они в присутствии кислорода — образование перскисных свободных радикалов белка. При­чиной возникновения хемилюминесценции как раз и яв­ляются реакции «первичных» и перекисных свободных радикалов.

Таким образом, в модельной системе ретиналь — бе­лок фотоокисление, судя по всему, идет по II типу — физической фотосенсибилизации; ретиналь выступает здесь как триплетный фотосенсибилизатор.

Следующий очередной шаг: исследование фотоокисле­ния молекулы родопсина в фоторецепторной мембране. Предметом экспериментального исследования было окис­ление сульфигидрильных (тиоловых) групп белковой ча­сти молекулы. Установлено, что практически все SH-группы в фоторецепторной мембране принадлежат имен­но родопсину. Будучи тиоловым белком, родопсин в принципе должен быть легко подвержен окислению. Ма­ло того что он может повреждаться в результате фотосенсибилизированного окисления, но на него в фоторе­цепторной мембране могут оказывать сильное влияние токсические продукты перекисного окисления липидов (о перекисном окислении липидов в механизме фото­повреждения речь впереди). Уязвимость SH-групп ро­допсина при действии на сетчатку яркого видимого све­та несомненна (рис. 1): чем дольше мы ее освещали, тем меньше SH-групп оставалось.

Естественно, возникает вопрос: играет ли (как и в модельной системе с трипсином) ретиналь роль сенси­билизатора в фотоокислении SH-групп родопсина и если да, то какой путь окисления основной — первый (хими­ческая сенсибилизация) или второй (физическая сенси­билизация)?

На первый вопрос, как нам думается, легко дать вполне определенный ответ: «Да, ретиналь способен вы­ступать здесь в качестве сенсибилизатора». Наиболее наглядный опыт — снятие спектра действия фотоокис­ления SH-групп родопсина. В фотосенсибилизированных реакциях он должен соответствовать спектру поглоще­ния хромофора — сенсибилизатора. Полученный спектр действия (рис. 2) был сдвинут в синюю область, т. е. как раз в ту область видимого спектра, в которой рас­положен максимум спектра поглощения ретиналя, сво­бодного или связанного с белком. Скорость окисления родопсина, как было показано в тех же опытах, зависит от концентрации добавленного извне ретиналя. В последнее время были получены данные, подтверждающие возможность участия синглетного кислорода в фото­окислении SH-групп родопсина.

Окисление молекулярных компонентов фоторецепторной мембраны и защитное действие на этот процесс антиоксидантов...; Повреждение сетчатки глаза...

Окисление молекулярных компонентов фоторецепторной мембраны и защитное действие на этот процесс антиоксидантов…; Повреждение сетчатки глаза…

Следовательно, ретиналь правомерно рассматривать в качестве сенсибилизатора фотоокисления SH-групп ро­допсина с участием активной формы кислорода.

Известно, что среднее значение квантового выхода фотоокисления белков около 0,04. Если квантовый выход фотоокисления родопсина окажется соизмеримым с этим значением, то это будет означать, что квантовый выход фотоокисления родопсина почти на порядок ниже, чем квантовый выход его фотообесцвечивания (как мы пом­ним, величина квантового выхода фотоизомеризации 11-цисретиналя и обесцвечивания родопсина — около 0,7). Отсюда ясно, что для фотоокисления родопсина, к сча­стью, требуется гораздо больше квантов света, чем для его фотообесцвечивания(фотолиза). В противном слу­чае физиологические интенсивности света превратились бы в патологические.

Рассмотрим теперь возможный механизм фотоокис­ления липидов.

Половина сухого веса фоторецепторной мембраны приходится на долю липидов. В состав молекулы липи­да входят жирные кислоты; ненасыщенные жирные ки­слоты легко окисляются. Жирнокислотный состав липи­дов фоторецепторной мембраны совершенно уникален: никакая другая биологическая мембрана не содержит такого большого количества ненасыщенных жирных ки­слот. Особенно много в этой мембране (более 50%) по­линенасыщенной кислоты, содержащей 22 углеродных атома и 6 двойных связей. Твердо установлено, что чем больше в жирной кислоте двойных связей, тем легче она окисляется, можно сказать, сгорает. Жирно-кислотный состав липидов фоторецепторной мембраны сохраняет­ся неизменным в самых неблагоприятных для организ­ма ситуациях, например, когда в диете катастрофически не хватает жирных кислот. Даже накануне летального исхода, когда липидный состав мембран всех тканей изменен, в мембранах зрительных клеток все остается по-прежнему. Организм до последнего борется за сохран­ность зрения, за неизменность состава своей фоторецеп­торной мембраны.

Дефицит полиненасыщенных жирных кислот приво­дит к патологическим последствиям. Вязкость полинена­сыщенных кислот очень низкая, поэтому липидный би­слой фоторецепторной мембраны — жидкий, подобный консистенции жидкого оливкового масла. Молекулы ро­допсина испытывают в этой мембране быструю враща­тельную и более медленную латеральную диффузию. По всей видимости, для нормального функционирования в фоторецепторной мембране свобода перемещения моле­кулы родопсина, низкая вязкость липидного окружения совершенно необходимы.

Свободнорадикальное перекисное окисление ненасы­щенных жирных кислот липидов фоторецепторной мем­браны не менее опасно, чем родопсина. Поэтому выяс­нение фотохимических механизмов окисления липидов — задача актуальнейшая. Что известно сейчас по этому поводу?

Известно, что ретиналь на последних стадиях фото­лиза родопсина способен мигрировать с белковой части родопсина на содержащий аминогруппу липид, Такие липиды в фоторецепторной мембране имеются, притом в большом количестве. Установлено, что спектр дейст­вия фотоокисления липидов такой же, как и родопсина. Следовательно, ретиналь вполне реальный кандидат на роль фотосенсибилизатора окисления не только SH-груп­пы родопсина, но и липидов. Прямое фотоокисление ли­пидов в биологических системах маловероятно, посколь­ку они поглощают в области 220 нм. До поверхности Земли, как мы знаем, такой «жесткий» коротковолно­вый ультрафиолет не доходит.

Разрушение липидов под действием длинноволнового ультрафиолета в области 280—290 нм вполне вероятно; в таком случае сенсибилизаторами могут служить бел­ки. Не исключено поэтому, что обесцвеченный родопсин, тесно связанный с липидами, вполне может выступать в роли фотосенсибилизатора их окисления. Наиболее вероятный сенсибилизатор фотоокисления липидов в фо­торецепторной мембране, по всей видимости, ретиналь. В любом случае возникшие в ходе фотосенсибилизированной реакции радикалы липидов взаимодействуют с кислородом, превращаясь в радикалы перекисного типа. Фотоокисление липидов в фоторецепторной мембране, согласно полученным нами данным, идет в основном по механизму I типа — химической сенсибилизации.

Следовательно, можно предположить, что фотосен­сибилизированное ретиналем окисление и родопсина, и липидов в фоторецепторной мембране происходит одно­временно и параллельно. Причем (теория фотосенсиби­лизованных реакций это не запрещает) фотоокисление липидов идет в основном по механизму I типа — хими­ческой сенсибилизации, а родопсина, скорее всего, по механизму II типа — физической сенсибилизации с уча­стием синглетного кислорода. Факт фотосенсибилизиро­ванного ретиналем образования синглетного кислорода недавно установлен. Поскольку к ингибиторам свобод­ных радикалов реакции II типа не столь чувствительны, то не вызывает удивления полученный результат: изве­стный ингибитор перекисного окисления липидов — ионол (фармакологическое название «дибунол»), пред­ложенный одним из авторов этой брошюры для широ­кого применения в биологии и медицине, полностью пре­дотвратил фотоокисление липидов и лишь частично сни­зил скорость окисления SH-групп родопсина.

«Свободные радикалы», «ингибиторы свободнорадикальных процессов», «скорости реакции» — все это тер­мины химической физики. Однако, как мы видим, без них не обойтись при рассмотрении молекулярных меха­низмов нормальных и патологических процессов в зри­тельных клетках. «Глаз и Солнце» — в полной мере проблема химико-физическая; идеи и методы этой науки вторгаются в физиологию, биохимию и биофизику зре­ния.